脱氧胆酸或脱氧胆酸盐作为吸收促进剂在制备预

本发明涉及生物医学，具体而言，涉及脱氧胆酸或脱氧胆酸盐作为吸收促进剂在制备预防或治疗hp感染的口服免疫原性组合物中的应用。背景技术：1、幽门螺杆菌(helicobacter pylori，hp)是一种革兰阴性、螺杆状、微需氧菌，可以在胃、黏膜和十二指肠上皮持续存在。hp感染在全世界各地人群中感染率均较高，全球感染率超过50％。目前抗生素治疗hp感染虽然具有一定积极的临床意义但仍存在如下缺陷：1)毒副作用；2)易产生耐药菌株；3)费用高；4)疗程长，患者顺应性差；5)疗效不稳定等。疫苗是控制感染性疾病最为经济有效的办法，因此通过hp疫苗刺激机体产生针对幽门螺杆菌的特异性免疫应答，可以达到预防或者治疗hp感染的目的。2、然而，口服疫苗的开发仍然存在着重重困难。一方面，口服递送疫苗必须途经恶劣的胃肠道环境，抗原在胃肠道中除了要经受较宽范围的ph梯度变化(1.2～8.6)，还要经受不同的机械过程如肠道蠕动，粘液和多糖包被的捕获以及消化酶(蛋白酶，脂肪酶，核酸酶，胆汁，乳铁蛋白，酶和过氧化物酶)的攻击，这些将导致抗原稀释、降解甚至变性失活。另一方面，按生物药剂学分类系统(biopharmaceutics classification system)进行分类，疫苗抗原多为水溶性大分子，这类物质的水溶性较好，但渗透性较低。因此，口服后机体产生的抗体滴度低。3、此外，现有技术(“重组幽门螺杆菌尿素酶b亚单位鼻腔免疫凝胶剂的研制”，高志刚等，《中国现代应用药学》)虽然有报道脱氧胆酸钠作为鼻腔黏膜吸收促进剂，用于制备鼻腔重组幽门螺旋杆菌尿素酶b亚单位疫苗凝胶剂，然而由于滴鼻和口服的给药方式技术要求完全不同，需要解决的技术问题也有明显差异，在药剂学上属于明显不同的领域。首先，鼻腔黏膜与胃肠道环境完全不同，且鼻腔黏膜根本不涉及机械过程如肠道蠕动、相对恶劣的ph环境以及多种消化酶的攻击；并且幽门螺杆菌为一种胃肠道感染细菌，鼻腔给药需要在远距离粘膜部位产生免疫应答，而口服给药可以在就近粘膜部位产生免疫应答；最后，鼻腔给药制剂为了解决抗原的滞留问题，加入了能够形成凝胶的卡伯波-934，但无佐剂的使用。4、胰岛素口服制剂的研究中(a.yamamoto,e.hayakawa,y.kato,a.nishiura,v.h.lee,a mechanistic study on enhancement of rectal permeability to insulinin the albino rabbit,j pharmacol exp ther)虽然也有添加脱氧胆酸钠的报道。该报道中脱氧胆酸钠能够提高打开肠道紧密连接，或帮助药物通过细胞旁路吸收；同时克服胰岛素口服的吸收屏障、酶屏障和粘液屏障，能够提高药物的口服生物利用度。脱氧胆酸钠促进胰岛素的吸收需要经过肠道上皮细胞或细胞旁路途径进入血液循环，进而分布到全身，与细胞表面的胰岛素受体结合发挥作用。然而，抗原和佐剂的吸收是通过肠道m细胞和杯状细胞将其摄取并递送至树突状细胞(dc)，或是由单核吞噬细胞(mnp)通过肠上皮中的紧密连接或是m细胞中的孔延伸树突摄入抗原。抗原提呈细胞摄入抗原并且被佐剂活化后，进而活化下游t、b免疫细胞，产生免疫应答。所以，抗原和佐剂与胰岛素口服制剂相比，进入机体的靶细胞和发挥作用的靶组织都是明显不同的。并且，由于胰岛素口服剂治疗的对象是糖尿病，与hp感染技术领域、治疗机理差异明显，脱氧胆酸钠是否能提高疫苗口服后机体的抗体滴度存疑。因此，如何提高疫苗口服后机体的抗体滴度是亟需解决的问题。5、鉴于此，特提出本发明。技术实现思路1、本发明的目的在于提供脱氧胆酸或脱氧胆酸盐作为吸收促进剂在制备预防或治疗hp感染的口服免疫原性组合物中的应用以解决上述技术问题。2、本发明是这样实现的：3、第一方面，本发明提供了一种脱氧胆酸盐作为吸收促进剂在制备预防或治疗幽门螺杆菌感染的口服免疫原性组合物中的应用。4、本发明经过长期大量的实验，发现导致疫苗口服后机体产生的抗体滴度低的原因是：苛刻的胃酸环境和蛋白酶的降解作用严重影响抗原在胃肠道的稳定性；肠道各种生理屏障使得抗原在黏膜部位的渗透能力降低，最终导致口服免疫失败，因此疫苗口服后机体的抗体滴度低。5、基于此，本发明筛选提供了一种吸收促进剂—脱氧胆酸或脱氧胆酸盐，发现脱氧胆酸或脱氧胆酸盐能够作为吸收促进剂提高机体的免疫应答水平，大幅提高机体中抗体的滴度，能明显提高幽门螺杆菌血清特异性igg和肠道特异性siga，具有良好的制备口服免疫原性组合物的应用前景。6、本发明中使用的术语“免疫原性组合物”是指包含疫苗活性成分(包括不限于抗原分子)，并且将组合物施用给受试者能够在受试者中引起体液和/或细胞抗原特异性反应的组合物。7、本发明中使用的术语“受试者”是指哺乳动物，优选人。8、在本发明应用较佳的实施方式中，脱氧胆酸盐选自脱氧胆酸钠、脱氧胆酸钾和脱氧胆酸钙中的至少一种。9、脱氧胆酸或脱氧胆酸盐通过作为幽门螺杆菌口服免疫原性组合物(如口服亚单位疫苗)吸收促进剂存在多种作用机制：一、肠上皮细胞表面覆盖着由黏蛋白、电解质等构成的黏液层。脱氧胆酸钠可降低黏液层的黏度和弹性，促进幽门螺杆菌抗原透过黏液层。二、脱氧胆酸钠可与细胞膜磷脂双分子层相互作用，改变膜中脂质和蛋白质的分布，降低磷脂双分子层的有序性，增加流动性和通透性，从而促进幽门螺杆菌抗原透过胃肠道上皮细胞膜。三、脱氧胆酸钠能在细胞膜表面形成反相胶束，从而创造细胞膜表面的亲水孔隙，进而促进幽门螺杆菌抗原被上皮细胞吸收。四、脱氧胆酸钠可结合ca2+，影响肌球蛋白的分布和功能，放松细胞间紧密连接，从而增加细胞旁路转运，进而导致幽门螺杆菌抗原的摄取增加。五、脱氧胆酸钠可与幽门螺杆菌抗原形成复合物，从而增加抗原对生物膜的通透性，进而增加抗原的生物利用度。六、脱氧胆酸钠能抑制p-糖蛋白(p-gp)的外排作用，从而增加幽门螺杆菌抗原的吸收。七、脱氧胆酸钠还能抵抗蛋白酶对于幽门螺杆菌抗原的降解，从而增加抗原的黏膜吸收。10、在本发明应用较佳的实施方式中，口服免疫原性组合物还包括疫苗活性成分和佐剂；疫苗活性成分选自幽门螺杆菌的抗原；抗原选自幽门螺杆菌的蛋白、多肽、多糖和寡糖中的至少一种。11、幽门螺杆菌的寡糖选自galβ4glcnac，galnacα3galβ4glcnac，galnacβ3galβ4glcnac，glcnacα3galβ4glcnac，glcnacβ3galβ4glcnac，galβ3galβ4glcnac，glcα3galβ4glcnac，glcβ3galβ4glcnac，galβ4glcnacβ3galβ4glcnac，galβ4glcnacβ3galβ4glc，galnacα3galβ4glcnacβ3galβ4glc，galnacβ3galβ4glcnacβ3galβ4glc，glcnacα3galβ4glcnacβ3galβ4glc，glcnacβ3galβ4glcnacβ3galβ4glc，galβ3galβ4glcnacβ3galβ4glc，glcα3galβ4glcnacβ3galβ4glc，glcβ3galβ4glcnacβ3galβ4glc，galanacβ3galβ4glcnac，galanacα3galβ4glcnac，galaβ3galβ4glcnac，galaα3galβ4glcnac，galanacβ3galβ4glc，galanacα3galβ4glc，galaβ3galβ4glc，galaα3galβ4glc，glcanacβ3galβ4glcnac，glcanacα3galβ4glcnac，glcaβ3galβ4glcnac，glcaα3galβ4glcnac，glcanacβ3galβ4glc，glcanacα3galβ4glc，glcaβ3galβ4glc，glcaα3galβ4glc，galβ4glcnacβ3galβ4glcnacβ3galβ4glc等。12、口服免疫原性组合物的形态包括不限于：固体(如冻干粉等)、液体或半固体。13、在本发明应用较佳的实施方式中，佐剂选自toll样受体激动剂、rig-i样受体激动剂、nod样受体激动剂、c-型凝集素受体、sting激动剂、细菌毒素及其衍生物、皂苷类、细胞因子和其他佐剂中的至少一种；其他佐剂选自热激蛋白、a151、gtp-gdp、氟化钠、烷基聚丙烯酯多聚体、二甲基双十八烷基季胺溴化物(dda)的至少一种。14、在本发明应用较佳的实施方式中，toll样受体激动剂选自cpg-odn、cpg 1018、肽聚糖、脂磷壁酸、mpla(单磷酸酰脂质a)、咪喹莫特、瑞喹莫特、细菌鞭毛蛋白和poly i:c(聚肌胞)中的至少一种。此外，toll样受体激动剂包括不限于tlr1，tlr2，tlr4，tlr5和tlr9的激动剂。15、cpg 1018佐剂是一种tlr9激动剂，既能够刺激b细胞，促进体液免疫；同时也能刺激树突状细胞活化，进而刺激特异性t细胞、产生记忆细胞，显著强于传统铝佐剂。16、cpg odn佐剂，即cpg寡核苷酸(cpg oligodeoxynucleotides,cpg odn)是指一类以未甲基化cg二核苷酸为核心的寡聚核苷酸序列，cpg odn可以激活tlr9受体，是一种有潜力的疫苗佐剂，能够增强疫苗的免疫反应强度、广度和持久性。cpg odn佐剂包括不限于a、b、c三类，即cpg-a odn、cpg-b odn和cpg-c odn；包括不限于odn 2216、odn 2006、odn2395。17、多聚体cpg-a odn主要定位于早期溶酶体，在浆细胞样树突状细胞中，它们导致ifn-α的强烈诱导。单体cpg-b odns集中在晚期内体区室，可以促进浆细胞样树突状细胞和b细胞的细胞成熟。cpg-c odn定位于两个区室，诱导ifn-α的产生和细胞成熟。影响含cpg序列生物效应的其他结构修饰包括通过非核苷化学连接体连接两个或多个短的硫代磷酸酯骨架cpg odn，以产生线性嵌合免疫调节化合物和/或含cpg纳米颗粒化合物的制剂。18、rig-i样受体激动剂选自3prna和短的双链rna中的至少一种；19、nod样受体激动剂选自胞壁酰二肽(mdp)和n一乙酰葡萄糖胺中的至少一种；20、c-型凝集素受体选自β-葡聚糖和海藻糖二硼酸盐中的至少一种。21、sting激动剂选自cgamp、c-di-amp和c-di-gmp中的至少一种；cgamp包括不限于3’-3’cgamp和2’-3’cgamp。22、细菌毒素及其衍生物选自霍乱毒素及其亚单元和大肠杆菌不耐热肠毒素及其亚单元中的至少一种。23、霍乱毒素(ct)和大肠杆菌不耐热肠毒素(lt)都属于a-b型细菌蛋白毒素家族，而且两者的氨基酸序列80％的相同。ct是由a、b两种亚单位组成的ab型结构的六聚体蛋白，a亚单位(cta)有240个氨基酸，在第192位氨基酸被蛋白酶裂解后可以生成cta1和cta2两个部分，二者以二硫键相连。cta1具有adp-核糖基转移酶的作用。cta2的主要功能是连接cta1和b亚单位(ctb)。24、cpg的序列可分为三大类：cpg-a类、cpg-b类和cpg-c类。25、皂苷类选自qs21、番茄苷和quil-a中的至少一种；26、细胞因子选自gm-csf、il-2、il-12、il-6、ifn-γ、flt-3和淋巴细胞趋化因子中的至少一种。27、在本发明应用较佳的实施方式中，霍乱毒素亚单元选自ctb，大肠杆菌不耐热肠毒素亚单元选自ltb。28、ct(lt)发挥毒素的大致作用过程为ctb通过神经节苷脂1(gm1)的结合位点与细胞表面的gm1受体结合，经过吞噬作用ct进入细胞，主动转运至内质网，cta与ctb分离，进入细胞质。目前认为，lt和ct主要通过以下方式诱导粘膜免疫反应:1，增加上皮细胞的渗透性，增强抗原吸收；2，增强不同抗原呈递细胞的抗原呈递作用；3，调节b细胞的分化，使siga的形成增加；4，诱导树突状细胞(dc)分泌白细胞介素1β(il-1β)；5，通过上调l-10，下调l-12，选择性地影响细胞表面分子的表达，抑制thl细胞的产生，增强t细胞的调节活性。但是值得注意的是，细菌毒素的佐剂效应并不仅仅涉及一种机制，而是多种机制协同作用的结果。29、在本发明应用较佳的实施方式中，组合物中，疫苗活性成分、佐剂和吸收促进剂的质量比包括不限于：(1-10)：(0.1-10)：(1-80)。组合物中，疫苗活性成分、佐剂和吸收促进剂的质量比例如是1:1:80、2:1:80、4:1:80、5:1:80、6:1:80、7:1:80、8:1:80、9:1:80、10:1:80、1：10:50、1:5:5或1:10:60。30、佐剂的类型包括不限于：水包油乳液、油包水、水包油包水乳液。31、在本发明应用较佳的实施方式中，幽门螺杆菌的抗原选自urea、ureb、caga、vaca、kata、hspa、hpaa、hpa、hp-nap、omp、sod、tpx、vaca、ggt、baba、saba、feca、omp16、napa、cat、lpp20、选自以上任意一种抗原的修饰物、及选自以上任意一种抗原的突变体、选自以上至少一种抗原的融合蛋白和选自以上至少一种抗原表位肽中的任意一种。32、抗原的修饰物包括不限于：对抗原上的氨基酸残基进行甲基化、乙酰化、磷酸化、泛素化、adp核糖化、烷基化、酰化emts修饰和dtnb修饰。33、抗原表位肽又称抗原决定簇或抗原决定基(antigenic determinant,ad)，指抗原分子中决定抗原特异性的特殊化学基团。通常是抗原表面上的一至六个单糖或五至八个氨基酸的残基。由于抗原分子处于空间环境中，抗体识别的表位可能取决于实际存在的三维抗原构象(例如，由两个天然蛋白质环或亚基相互作用形成的独特位点)。这就是所谓的构象表位。表位也可对应于简单的氨基酸线性序列，这种表位称为线性表位。34、本发明具有以下有益效果：35、本发明提供了一种吸收促进剂—脱氧胆酸或脱氧胆酸盐，脱氧胆酸或脱氧胆酸盐能够作为吸收促进剂提高机体的免疫应答水平，大幅提高机体中抗体的滴度，能明显提高幽门螺杆菌血清特异性igg和肠道特异性siga，具有良好的制备口服免疫原性组合物的应用前景。