一种多价核酸适体在制备促进T细胞靶向识别并杀

本发明属于肿瘤免疫治疗领域，具体涉及了一种多价核酸适体在制备促进t细胞靶向识别并杀伤肿瘤细胞制剂中的应用。背景技术：1、肿瘤的免疫治疗是一种新兴的癌症治疗方式，在多种恶性肿瘤的治疗过程中展现出独特的优势。免疫治疗利用患者自身的免疫系统来识别并攻击癌细胞，相较于传统的化学疗法和放射疗法，对患者的副作用更低，因此已经逐渐成为多种癌症治疗方案的首选之一。目前常见的免疫疗法包括单克隆抗体、免疫检查点抑制剂、mrna疫苗以及嵌合抗原受体免疫疗法(car-t)治疗等。其中，car-t细胞疗法通过基因工程在体外改造患者的t细胞，在其表面修饰上用于靶向识别癌细胞的嵌合抗原受体，然后通过体外扩增再输回患者体内进行癌症的治疗。尽管car-t疗法在多种实体瘤与血液瘤中已经崭露头角，但其复杂的治疗过程和昂贵的医疗费用限制了其进一步的推广。2、此外，通过双靶向抗体促进肿瘤免疫微环境中t细胞对于肿瘤细胞的识别，也取得了一定的成果。针对t细胞淋巴瘤的治疗策略，构建了针对cd30和cd5的高亲和力和特异性纳米抗体，并成功将其应用于双特异性car-t细胞治疗。相较于传统car-t细胞，基于纳米抗体的双特异性car-t细胞在体内外展现出显著提高的抗肿瘤效果，为t细胞淋巴瘤患者的靶向治疗带来了新的希望。然而，抗体自身存在着易脱靶、易被降解、双靶向抗体合成困难等问题仍待解决。3、20世纪70年代，单克隆抗体技术的问世曾为医学界带来了战胜癌症的希望。单克隆抗体具有与靶标分子(尤其是肿瘤抗原)特异性结合的能力，并携带细胞毒性，从而在破坏肿瘤细胞的同时最大程度地减少对正常细胞的损害。尽管在生物医学研究和多种癌症的临床诊断与治疗中证明了单克隆抗体的用途，但总体而言其效果并未达到预期水平。4、在20世纪90年代，另一种体外进化技术即指数富集配体系统进化技术(selex)的出现引起了广泛关注。selex技术被用于生产具有高特异性和结合亲和力的寡核苷酸，被称为核酸适体。核酸适体具有多种二级结构，例如茎环结构、发卡结构、假结结构等，以及独特的三维结构，并可以通过空间互补、静电/离子相互作用、氢键、范德华力和疏水作用等作用力与靶标分子结合。5、与单克隆抗体相比，核酸适体具有诸多优势。首先，核酸适体通过selex体外过程筛选得到，生产成本更低。其次，核酸适体的尺寸更小，能够更好地渗透组织。此外，核酸适体的结构可逆，可根据ph和温度发生变化。值得注意的是，在体内应用方面，核酸适体几乎没有免疫原性，因此不会引起体内免疫排异反应。目前，fda已经批准了靶向血管内皮生长因子(vegf)的核酸适体药物izervay，用于治疗年龄相关的黄斑变性。6、与传统的单一核酸适体相比，多价核酸适体是一种特殊类型的核酸适体，它具有多个结合位点，可以同时与多个目标分子结合。多价核酸适体通常通过将单一核酸适体单元连接在一起来构建，从而增加了其结合目标的亲和力和特异性，提高了其在生物学和医学领域的应用潜力。由于多价核酸适体通过多个结合位点与目标结合，可以减少与非特异性结合的可能性，从而提高了其对目标的特异性识别能力。此外，多价核酸适体可以作为药物的载体，相比较单价核酸适体，它具有更多的载药位点，因而相同含量下多价核酸适体具有更大的载药量，可以实现对于肿瘤细胞、炎症部位或其他疾病相关分子特异性识别和药物递送，从而提高了治疗效果。7、目前，已有多种构建多价核酸适体的方法被提出，常见的有基于无机纳米材料构建多价核酸适体、基于二酰基脂质构建多价核酸适体、基于聚合物纳米颗粒构建多价核酸适体、基于dna纳米技术构建多价核酸适体以及基于碳纳米、金属有机框架组合等方法构建多价核酸适体。其中，基于无机纳米材料构建多价核酸适体最为广泛使用。无机纳米材料随着技术发展，已经能够做到精确控制形状、大小和表面化学性质，并由于其独特的性质例如小尺寸、特殊的光学性质以及易于生物功能化，在生物传感、成像、癌症诊断与治疗等领域被广泛使用。利用其高表面积与体积比的优势，无机纳米材料可以搭载多种核酸适体形成多价核酸适体。这些多价核酸适体一方面提高了纳米材料对于肿瘤细胞的识别和靶向递送能力，另一方面纳米材料也增加了核酸适体的密度与亲和力，并提高了核酸适体在血液中的循环时间。在这些无机纳米材料中，金纳米颗粒由于其稳定性高、易于合成与修饰等特点，搭载核酸适体形成的多价核酸适体最为广泛研究。8、然而，无机纳米材料由于其自身的特性在生物医学领域也面临许多挑战与限制。无机纳米材料的生物相容性一直是一个比较有争议的话题，尤其是无机纳米材料在体内无法被细胞摄取或快速代谢，并且对于它们的长期影响与安全性的数据研究依然十分有限。此外，通过无机纳米材料搭载核酸适体较难精确控制表面核酸适体的具体数量以及不同适体之间的比例。因此，通过无机纳米材料搭载核酸适体形成多价核酸适体在实际应用中依旧面临极大的挑战。总之，现有的多靶向核酸适体的抗酶切能力有待增强，且生物相容性还需要进一步探究。此外，通过这些方式构建的多价核酸适体往往存在价态不可控的局限性。9、基于上述原因，研究人员迫切需要寻求一种具有更高生物安全性并且可精确模块化控制多价核酸适体结构的方式。本发明运用修饰基团间的化学反应构建合成多价核酸适体骨架，再通过酶连接方式合成最终多价核酸适体。此方法通过两步反应可以精确调控多价核酸适体价态，并且可模块化组成结构中每一个核酸适体类型，以此满足不同生物学应用需求。技术实现思路1、本发明的目的在于提供一种多价核酸适体在制备促进t细胞靶向识别并杀伤肿瘤细胞制剂中的应用。本发明制备的多价核酸适体通过核酸适体与t细胞靶向结合后，可以长时间停留在t细胞膜表面，其中多价核酸适体另一端暴露在外面，因此赋予了t细胞能够靶向识别肿瘤细胞的能力。尤其是通过采用修饰基团化学反应与酶连法相结合的方式，模块化构建多价核酸，能够做到价态可控。通过该方法至少可以合成得到三价及以上的多价态核酸，并且已经成功合成了三、四、五、六价态核酸(即三条、四条、五条、六条核酸链的聚合体)，可以根据不同生物学应用需求做到模块化堆砌多种不同核酸于一体，且抗酶切能力增强，能够多靶向识别。2、一种多价核酸适体在制备促进t细胞靶向识别并杀伤肿瘤细胞制剂中的应用，所述的多价核酸适体的制备方法：核酸适体单链的一端或两端或茎部分别修饰基团，然后通过修饰基团的化学反应与茎部碱基酶连法连接起来构建多价核酸适体；核酸适体单链的序列相同或者不同。3、本发明在t细胞表面锚定多价核酸适体，通过多价核酸适体靶向识别肿瘤细胞表面蛋白，促进t细胞对于肿瘤细胞的识别和免疫杀伤能力；所述的多价核酸适体的制备方法中修饰的基团至少发生下述的任一反应：4、叠氮基团和二苯基环辛炔基团的点击化学反应；5、叠氮基团和环辛炔基基团的点击化学反应；6、叠氮基团和炔基基团的点击化学反应；7、马来酰亚胺基团和呋喃基团的加成反应；8、马来酰亚胺基团和巯基基团的加成反应；9、nhs酯基基团和氨基基团的取代反应；10、硫代磷酸基团和氯乙酰基基团的sn2反应；11、氨基基团和羧基基团的缩合反应；12、茎部碱基酶连法是利用两条核酸适体链茎部碱基互补配对连接，之后再通过dna连接酶补齐缺口；包括使用以下至少一种dna连接酶：13、t4 dnaligase；14、t7 dnaligase；15、t4 rna ligase。16、所述的多价核酸适体的制备方法中具体包括以下合成顺序中的一种：17、(1)通过核酸适体链之间的修饰基团的化学反应构建多价核酸适体的合成中间体，再通过酶连法互补上核酸适体链形成多价核酸适体；18、(2)通过酶连法将核酸适体链之间相连构建多价核酸适体的中间体，再通过修饰基团的化学反应构建多价核酸适体。19、所述的多价核酸适体的制备方法中每条核酸适体单链浓度为0.025μm～50μm；优选0.1μm～50μm。20、所述的多价核酸适体的制备方法中采用超纯水、dpbs、te buffer+21、mg2+、pb+抗坏血酸钠中的至少一种做溶剂。22、所述的多价核酸适体的制备方法中修饰基团的化学反应温度为-20℃～37℃；修饰基团的化学反应时间为1h～24h；酶连反应温度37℃，时间为1h～24h。23、进一步地，将t细胞与多价核酸适体在缓冲液中共同孵育，孵育结束后，离心，去除上层清液，再将细胞洗涤，即得锚定有多价核酸适体的t细胞。24、更进一步地，25、t细胞与多价核酸适体在binding buffer中共同孵育，细胞浓度为1×104-1×106个细胞/ml，核酸适体浓度为50nm-5um，孵育温度为37℃，孵育时间至少30min；孵育结束后，转移入离心管中，在400-800rpm下离心2-5min后，去除上层清液，再用dpbs将细胞洗涤1-5次，即得。26、最优选：t细胞与多价核酸适体在binding buffer中共同孵育，细胞浓度为2×105个细胞/ml，核酸适体浓度为500nm，孵育温度为37℃，孵育时间为30min；孵育结束后，转移入1.5ml离心管中，在800rpm下离心3min后，去除上层清液，再用dpbs将细胞洗涤2次，即得。27、本发明所述的肿瘤细胞包括血液瘤或实体瘤细胞。28、本发明还提供了一种促进t细胞靶向识别并杀伤肿瘤细胞制剂，是在t细胞表面锚定上述的多价核酸适体。本发明以核酸适体为例制备多价核酸适体，核酸单链均选自以下核酸适体中的任一种，自由组合：29、sgc8：atctaactgctgcg ccgccgggaaaatactgtacggttaga；30、xq-2d：actcatagggttaggggctgctggccagatactcagatg gtagggttactatgagc；31、as1411:ggtggtggtggttgtggtggtggtgg32、ld201t1:tgactgatttacgtagccaaggtaaccagtacaaggtgctaaacgtaatggcttcggcttac pd4s:cgcactatgttttacgagccgtttcctcggcagatagtaagtgcg mj5c:tacaggttctggggggtgggtggggaacctgtt td05:tgactgatttacgaggaggatagttcggtggctgttcagggtct cctcct33、其中，sgc8：颈环结构，包括但不限于靶向ccrf-cem细胞(人急性淋巴白血病细胞)；xq-2d：颈环结构，包括但不限于靶向k562细胞(人慢性髓原白血病细胞)；as1411：g4结构，包括但不限于靶向4t1细胞(小鼠乳腺癌细胞)；ld201t1:茎环结构，包括但不限于靶向jurkat细胞(人急性白血病t细胞)；pd4s：茎环结构，包括但不限于靶向cho-k1细胞(鼠源卵巢细胞)；mj5c：颈环结构，包括但不限于靶向hct116细胞(人结肠癌细胞)；td05:颈环结构，靶向migm蛋白。34、例如可以采用如下组合构建：35、1、三价核酸适体：36、(1)37、sgc8c：p-38、cgtaaatcagtcagtctaactgctgcgccgccgggaaaatactgtacggttagac39、sgc8c-dbco-1：p-tgactgatt(dbco)40、tacggtctaactgctgcgccgccgggaaaatactgtacggttagac41、sgc8-n3-1：gtctaactgctgcgccgccgggaaaatactgtacggttagac-n342、(2)43、sgc8c：p-44、cgtaaatcagtcagtctaactgctgcgccgccgggaaaatactgtacggttagac45、xq-2d-dbco-1：p-tgactgatt(dbco)46、tacggctcatagggttaggggctgctggccagatactcagatggtagggttactatgagc47、xq-2d-n3-1：48、actcatagggttaggggctgctggccagatactcagatggtagggttactatgagc-n349、2、四价核酸适体50、(1)51、sgc8c：p-52、cgtaaatcagtcagtctaactgctgcgccgccgggaaaatactgtacggttagac53、sgc8c-dbco-1：p-tgactgatt(dbco)54、tacggtctaactgctgcgccgccgggaaaatactgtacggttagac55、sgc8c-n3-1：p-tgactgatt(n3)56、tacggtctaactgctgcgccgccgggaaaatactgtacggttagac57、(2)58、sgc8c：p-59、cgtaaatcagtcagtctaactgctgcgccgccgggaaaatactgtacggttagac60、xq-2d-dbco-1：p-tgactgatt(dbco)61、tacggctcatagggttaggggctgctggccagatactcagatggtagggttactatgagc62、xq-2d-n3-2:p-tgactgatt(n3)63、tacggctcatagggttaggggctgctggccagatactcagatggtagggttactatgagc64、3、五价核酸适体65、(1)66、sgc8c：p-67、cgtaaatcagtcagtctaactgctgcgccgccgggaaaatactgtacggttagac68、sgc8c-dbco-1：p-tgactgatt(dbco)69、tacggtctaactgctgcgccgccgggaaaatactgtacggttagac70、n3-sgc8c-n3-1：n3-71、gtctaactgctgcgccgccgggaaaatactgtacggttagac-n372、(2)73、sgc8c：p-74、cgtaaatcagtcagtctaactgctgcgccgccgggaaaatactgtacggttagac75、xq-2d-dbco-1：p-tgactgatt(dbco)76、tacggctcatagggttaggggctgctggccagatactcagatggtagggttactatgagc77、n3-xq-2d-n3-1：n3-78、actcatagggttaggggctgctggccagatactcagatggtagggttactatgagc-n379、4、六价核酸适体80、(1)81、sgc8c：p-82、cgtaaatcagtcagtctaactgctgcgccgccgggaaaatactgtacggttagac83、sgc8c-dbco-1：p-tgactgatt(dbco)84、tacggtctaactgctgcgccgccgggaaaatactgtacggttagac85、n3-sgc8c-n3-1：p-tgactgatt(n3)86、tacggtctaactgctgcgccgccgggaaaatactgtacggtt(n3)agac87、(2)88、sgc8c：p-89、cgtaaatcagtcagtctaactgctgcgccgccgggaaaatactgtacggttagac90、xq-2d-dbco-1：p-tgactgatt(dbco)91、tacggctcatagggttaggggctgctggccagatactcagatggtagggttactatgagc92、n3-xq-2d-n3-2:p-tgactgatt(n3)93、tacggctcatagggttaggggctgctggccagatactcagatggtagggttactat(n3)gagc94、本发明进一步以cd8+t细胞和4-xq-2d-sgc8(即实施例1中制备的四价核酸适体)的四价核酸适体为例，进行实验：95、(1)cd8+t细胞与多价核酸适体在binding buffer中共同孵育，细胞浓度为2×105个细胞/ml，核酸适体浓度为500nm，孵育温度为37℃，孵育时间为30min；孵育结束后，转移入1.5ml离心管中，在800rpm下离心3min后，去除上层清液，再用dpbs将细胞洗涤2次，即得。96、(2)将锚定有双靶向四价核酸适体的cd8+t细胞与肿瘤细胞1:1混合，并加入细胞培养液，放入细胞培养箱中共同孵育12h、24h，观察肿瘤细胞的存活率；97、(3)将锚定有双靶向四价核酸适体的cd8+t细胞通过尾静脉注射进入血液瘤小鼠或荷瘤小鼠体内，通过观察小鼠体内肿瘤细胞荧光信号强度或实体瘤尺寸来判断治疗效果。98、但本发明不局限于采用4-xq-2d-sgc8这一种双靶向四价核酸适体用于促进t细胞对于肿瘤细胞的免疫杀伤效果。99、本发明可以根据不同的t细胞和肿瘤细胞采取针对的核酸适体。100、本发明不局限于针对ccrf-cem急性淋巴白血病和hct116结直肠癌的治疗。101、本发明不局限于针对血液瘤或实体瘤的治疗。102、本发明利用多价核酸适体作为分子胶，增强了t细胞对肿瘤细胞的识别与杀伤。系统研究了多价核酸适体对肿瘤细胞和t细胞的毒性，并探究了在不同效靶比下多价核酸适体对促进t细胞对肿瘤细胞的杀伤效果，同时通过多种细胞因子的检测进行了辅助验证。最后，在实体瘤小鼠模型和血液瘤小鼠模型中验证了多价核酸适体促进t细胞对肿瘤细胞的免疫治疗效果。103、本发明锚定有多价核酸适体的t细胞通过表面的核酸适体识别肿瘤细胞表面的蛋白，实现了对于肿瘤细胞的识别与拉近。之后，t细胞包裹肿瘤细胞，并释放il-2、ifn-γ、tnf-α和granzyme b等细胞因子用于杀伤肿瘤细胞，使得肿瘤细胞死亡。104、本发明克服了传统car-t治疗繁琐的且昂贵的缺陷，并且通过生物体外细胞实验和小鼠肿瘤模型验证了，多价核酸适体锚定策略能够对于多种肿瘤类型都具有优异的治疗效果。