新型溶瘤病毒VG161联合紫杉醇在乳腺癌治疗上的应

本发明属于生物医药，具体涉及新型溶瘤病毒vg161联合紫杉醇在乳腺癌治疗上的应用。背景技术：1、乳腺癌是全球女性最常见的癌症。虽然乳腺癌的研究已有30年的历史，但仍有约90％的乳腺癌患者死于复发和转移。目前，手术和化疗是主要的治疗选择。紫杉醇(ptx)经常被用作乳腺癌的一线治疗药物，但乳腺癌对ptx固有性和获得性的耐药方面往往会影响其应用。因此，迫切需要关于如何提高其疗效和开发化疗耐药替代治疗方法的新策略。2、溶瘤病毒治疗通过在癌细胞中选择性复制，诱导宿主抗肿瘤免疫，正在成为癌症治疗的一种新的治疗方式。多项临床研究证明了其优异的安全性和有效性。通过表达人粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(gm-csf)刺激抗肿瘤免疫应答，选择通过多种机制(包括直接溶瘤作用)显示出较强肿瘤杀伤活性的几种候选药物(如hf10)和talimogenelaherparepvec(t-vec)进行溶瘤免疫治疗。然而，这类疗法的总体持久抗肿瘤反应仍然有限。因此，需要提高溶瘤病毒的疗效，让更多的溶瘤病毒进入主流癌症治疗。3、一种名为vg161的新型单纯疱疹病毒1型(hsv-1)的溶瘤病毒(ov)被本发明团队鉴定为溶瘤剂，其携带il12、il15及其受体α单位(il15ra)和pd-l1肽阻断剂(pdl1b)，能够将四种免疫调节因子送至肿瘤微环境。chouljenko等人已经证明，通过将强效溶瘤活性与广谱免疫刺激有效载荷结合，vg161可以诱导强烈的溶瘤作用并刺激持久的抗肿瘤免疫应答。vg161的抗肿瘤作用已在人肿瘤模型(lncap和u87)的裸鼠中得到验证，并在免疫活性小鼠(ct26和a20)中诱导强烈的抗肿瘤免疫应答。此外，首次人体试验表明，晚期难治性实体瘤患者单次肿瘤内注射(it)安全且耐受性良好。乳腺癌作为一种相对“冷”的肿瘤，肿瘤免疫原性差，有少量t细胞浸润和丰富的抑制性免疫细胞。因此，vg161可能通过改善乳腺癌的免疫微环境激发强烈的免疫反应。4、在本发明研究中，重点研究了vg161治疗乳腺癌的疗效，并在体内和体外探索了与ptx的联合治疗。本发明发现vg161显著抑制乳腺癌增殖并引起强烈的抗肿瘤免疫反应。综合考虑，vg161可以潜在地启动免疫系统克服对ptx的原发性耐药性，而ptx可以进一步增强vg161的免疫活性，且联合治疗耐受性良好，缓解率高。这种溶瘤病毒疗法可能为临床乳腺癌治疗带来曙光。技术实现思路1、本发明在当前研究的基础上，提供一种新型溶瘤病毒vg161在乳腺癌治疗上的新医药应用，同时提供新型溶瘤病毒vg161联合紫杉醇在乳腺癌治疗(主要指一线化疗)上的应用，本发明通过诱导肿瘤微环境的促炎变化，有效抑制乳腺癌生长，并减少乳腺癌肺转移，可广泛用于乳腺癌一线临床治疗及相关技术领域。2、溶瘤性单纯疱疹病毒(hsv)宿主范围广，具有肿瘤选择性病毒分布，可通过诱导直接细胞裂解和激活宿主免疫应答杀死癌细胞，是抗肿瘤治疗的理想候选病毒。疱疹病毒(hvs)载体的基因工程已被用作ov治疗，通过病毒的直接溶瘤作用杀死癌细胞并诱导宿主免疫。本发明所述的新型溶瘤病毒vg161是一种基因修饰的hsv，由il-12、il-15、il-15ra和能够阻断pd-1/pd-l1相互作用的融合蛋白(tf-fc)组成。3、基于此，本发明的第一方面，提供了新型溶瘤病毒vg161单药在治疗乳腺癌一线化疗方面的应用。4、通过所述新型溶瘤病毒vg161感染的乳腺癌细胞上清液，人il-12/il-15和pd-l1阻断剂(igg4)的表达强烈增加；为了进一步评估所述新型溶瘤病毒vg161诱导的抗肿瘤免疫反应，采用双重肿瘤emt模型，并通过cdna文库的高通式测序(rna-seq)检测了取自balb/c小鼠的emt6肿瘤中的免疫刺激通路，这些小鼠右侧接受所述新型溶瘤病毒vg161的治疗，左侧未接受所述新型溶瘤病毒vg161的治疗；在治疗或非治疗肿瘤中，几个免疫刺激通路如tnf信号、nf-κb信号和il-17信号通路均已被激活；同时对mvg161注射右侧和未注射左侧肿瘤切片进行染色和免疫组化成像，与溶剂组相比，显示cd3、cd4和cd8富集，提示肿瘤微环境中存在肿瘤浸润淋巴细胞；而且，基于ifnγ和tnfα的产生增加，所述新型溶瘤病毒vg161引起的抗肿瘤免疫的特征是稳健的；此外，肝肾功能检查指标未见异常变化，在体内显示出安全性特征。5、作为一种优选，用moi范围为0.01-10的hvg161或mvg161感染sk-br-3、mda-mb-231、mcf-7和emt-6细胞24、48和72h，并通过cck-8试验定量测定细胞活力；所述新型溶瘤病毒vg161病毒以剂量依赖的方式抑制细胞的活力；体内进一步评价了emt6荷瘤动物瘤内接种后vg161的有效性；balb/c小鼠两侧原位植入emt-6细胞，右侧肿瘤连续5天瘤内注射pbs对照或mvg161，左侧肿瘤不给药；在接受mvg161给药的动物中，1×105和1×107pfu病毒注射侧的肿瘤显著消退；另外，通过1×107pfu mvg161病毒处理后，非注射侧肿瘤也消退；mvg161治疗显示肺转移发生率显著降低，这些数据证实所述新型溶瘤病毒vg161可有效抑制乳腺癌增殖和肺转移。6、因此，所述新型溶瘤病毒vg161作为唯一活性成分的药物组合物，能够用于作为治疗乳腺癌的药物。7、本发明的第二方面，提供了新型溶瘤病毒vg161联合紫杉醇(ptx)在治疗乳腺癌一线化疗方面的应用。8、溶瘤性单纯疱疹病毒通常与化疗联合使用，联合用药可实现比任一药物单独使用更有效的癌细胞杀灭；在本发明的乳腺癌模型中，结合所述新型溶瘤病毒vg161和ptx检测了体内和体外的抗肿瘤效率，用vg161或ptx预处理细胞24h，然后用ptx或vg161处理24h、48h和72h，cck8试验用于确认细胞活力；数据证实所述新型溶瘤病毒vg161和ptx联合处理比任一单独处理进一步抑制mcf-7和mda-mb-231细胞活力。9、作为一种优选，用所述新型溶瘤病毒vg161进行预处理，balb/c小鼠两侧原位植入emt-6细胞，右侧肿瘤或瘤内注射mvg161连续3天后进行ptx处理，或先用ptx预处理后感染mvg161；结果与vg161首先处理具有更高效抗肿瘤作用的体外实验一致。接下来，对右侧肿瘤上的促凋亡分子caspase-3进行了tunel检测和免疫组化分析，发现vg161-ptx组合可以诱导更大的细胞凋亡；这些结果表明，vg161预先存在的免疫应答增强了ptx消除乳腺癌细胞的作用。10、作为一种优选，在emt-6乳腺癌模型中，所述新型溶瘤病毒vg161与ptx联合治疗可减少转移性肺部病变，具体为将emt6-luc乳腺癌细胞原位植入balb/c小鼠体内，可有效转移至肺，形成转移性肿瘤，通过生物发光离体成像和苏木精和伊红(h&e)染色，vg161感染后肺转移性肿瘤显著减少，与ptx共同治疗后的同时，转移性肺部病灶进一步下降；且免疫组化分析显示在转移性肺部病变中增强促进cd3+和cd8+t细胞的肿瘤浸润；这些发现表明vg161联合ptx可降低乳腺癌肺转移，这为转移性肺癌的治疗提供了治疗思路。11、作为一种优选，所述新型溶瘤病毒vg161与ptx联合处理对肿瘤微环境(tme)的改变更大；为了确定vg161与ptx联合处理的抗肿瘤免疫应答，本发明使用流式细胞术分析了从免疫功能正常的balb/c小鼠切除的emt-6肿瘤中分离的细胞，这些小鼠用mvg161、ptx或其联合处理。mvg161注射后淋巴细胞，包括cd8+t细胞和nk细胞以及其中ifn-γ、tnf和cd107a的表达，髓系细胞包括巨噬细胞、m-mdscs和dc均增加，它们进一步增强后与ptx共同处理；这些数据表明，所述新型溶瘤病毒vg161与ptx联合治疗可显著调节tme，从而在乳腺癌中产生稳健的抗肿瘤免疫应答。12、本发明的第三方面，提供了一种新型溶瘤病毒vg161与ptx联合治疗乳腺癌所用的方法和材料，具体包括细胞活力试验、细胞培养、酶联免疫吸附试验(elisa)、rna-seq和分析、体内肿瘤模型和肺转移模型、流式细胞分析、tunel试验、免疫组织化学、免疫荧光染色和显微镜检查、生化参数测量、graphpad prism 5(la jolla,ca,usa)统计分析。13、本发明的第四方面，提供了一种治疗乳腺癌的药物组合物，由新型溶瘤病毒vg161以及药学上可接受的辅料组成。14、相比现有技术，本发明的有益效果为：一种新型溶瘤病毒vg161在乳腺癌一线化疗的新医药应用，本发明所采用的新型溶瘤病毒vg161可抑制乳腺癌和肺转移，同时可增强乳腺癌的免疫应答；通过将新型溶瘤病毒vg161和紫杉醇(ptx)联合来治疗乳腺癌，其在体内协同表现出更强的肿瘤抑制和肿瘤杀伤作用；在emt-6乳腺癌模型中，新型溶瘤病毒vg161与ptx联合治疗可减少转移性肺部病变；另外，新型溶瘤病毒vg161与ptx联合治疗可显著调节肿瘤微环境(tme)，从而在乳腺癌中产生稳健的抗肿瘤免疫应答。15、本发明的新型溶瘤病毒vg161联合紫杉醇在乳腺癌一线化疗应用，为乳腺癌的临床治疗提供了新的治疗方案，新型溶瘤病毒vg161和紫杉醇联合应用可通过诱导肿瘤微环境的促炎变化，有效抑制乳腺癌生长，并减少乳腺癌肺转移，可为乳腺癌的临床治疗带来积极的效果，具有积极的推广应用价值。