用于控制鞘翅目昆虫的组合物和方法与流程

本披露涉及具有杀昆虫活性的新型杀有害生物蛋白、编码这些杀有害生物蛋白且其表达产生这些杀有害生物蛋白的核酸分子、以及用于控制作物植物的农业相关有害生物的组合物和方法。背景技术：1、昆虫是引起作物损失的一个主要原因。众多商业上有价值的植物(包括普通的农作物)易受植物有害生物(包括昆虫和线虫)攻击的影响，导致作物产量和品质大幅降低。例如，植物有害生物是导致全世界重要农作物损失的主要因素。昆虫有害生物对于菜农和果农，对于观赏性花卉的生产商也是负担，并且它们也给家庭花匠带来了困扰。2、玉米根虫的多个物种被认为是最具破坏性的玉米有害生物。在美国，三个重要的物种是玉米根萤叶甲(diabrotica virgifera virgifera，又称西方玉米根虫)、长角巴氏根萤叶甲(d.longicornis barberi，又称北方玉米根虫)、十一星根萤叶甲(d.undecimpunctata howardi，又称南方玉米根虫)。在美国玉米带中，只有西方和北方玉米根虫被认为是主要的玉米有害生物。另外，美国南部的一种重要的玉米根虫有害生物是墨西哥玉米根虫(墨西哥玉米根萤叶甲(diabrotica virgifera zeae))。玉米根虫幼虫通过几乎专一摄食玉米根而造成实质性的植物损害。已显示这种损伤增加了植物倒伏、减少了谷物产量以及营养产量连同改变了谷物的营养物含量。幼虫摄食还通过为潜在地导致根腐病和茎腐病的细菌和真菌感染打开了进入根部的途径，而对玉米造成了间接的影响。成年玉米根虫在晚夏时活跃在玉米地中，在此它们摄食穗、穗丝以及花粉，由此干扰了正常的授粉。3、玉米根虫主要是通过密集施用化学杀有害生物剂而得到控制的，这些化学杀有害生物剂通过抑制昆虫生长、预防昆虫摄食或繁殖、或者死亡而具有活性。因此，可以达到良好的玉米根虫控制，但并非没有一些低效现象。在一些情况下，这些化学品的应用会影响其他有益生物体。另外，化学杀有害生物剂的广泛使用会导致抗性昆虫品种的发展。最后，玉米根虫幼虫的地下进食偏好使得难以应用杀昆虫剂的挽救处理。因此，大多数杀昆虫剂应用是在种植时预防性地进行，这导致了很大的环境负担。通过各种农田管理实践已部分地改善了这种状况，但对替代性有害生物控制的机制存在着不断增加的需求。4、生物性有害生物控制剂，如表达杀有害生物毒素像δ-内毒素(δ-内毒素；也被称为结晶毒素或cry蛋白)的苏云金芽孢杆菌(bacillus thuringiensis)(bt)菌株，也已经施用至作物植物中，产生了针对昆虫有害生物的令人满意的结果。δ-内毒素是包含在晶体基质中的蛋白质，已知当被某些目和物种的植物有害生物(包括昆虫)摄入时具有杀昆虫活性，但对植物和其他非靶标生物体无害。来自苏云金芽孢杆菌的几种天然cry蛋白或工程化cry蛋白已经在转基因作物植物中表达以控制某些鳞翅目和鞘翅目昆虫有害生物，作为化学杀有害生物剂的替代或补充。自2003年以来，控制玉米根虫的转基因玉米杂交种已在美国市售，并表达毒素，例如cry3bb1、cry34ab1/cry35ab1、经修饰的cry3a(mcry3a)或cry3ab(ecry3.1ab)。5、尽管已经显示使用表达cry蛋白的转基因植物非常有效，但现在针对某些转基因植物中表达的cry蛋白具有抗性的昆虫有害生物是已知的。因此，仍需要鉴定新型且有效的有害生物控制剂，这些有害生物控制剂为农民提供经济益处并且是环境可接受的。特别需要的是对根萤叶甲属(diabrotica)物种(一种主要的玉米有害生物)有毒的蛋白质，与现有昆虫控制产品相比这些蛋白质具有不同的作用方式，以缓和抗性发展。此外，通过这些使环境负担最小化的产品(如通过转基因植物)递送昆虫控制剂是令人希望的。技术实现思路1、本披露提供了针对至少一种鞘翅目有害生物，例如针对玉米根虫(wcr，玉米根萤叶甲)具有杀昆虫性的多肽，以及这样的多肽和相关核酸在组合物和方法中的用途，例如在植物中或在控制鞘翅目有害生物的方法中的用途。2、因此，在一些方面，提供了多肽，其包含与seq id no:1具有至少15％同一性的氨基酸序列。本发明还涵盖与seq id no:1具有至少48％同一性或至少74％同一性的多肽。本发明的另外的方面包括包含seq id no:1-7中的任一个的多肽；包含seq id no:1-3或5-6中的任一个的多肽；包含seq id no:8-10中的任一个的多肽；包含seq id no:11或12的多肽；以及包含seq id no:29-136中的任一个的多肽。在一些实施例中，该多肽针对鞘翅目有害生物具有杀昆虫性。在一些实施例中，该多肽针对根萤叶甲属(diabrotica)有害生物(例如，玉米根萤叶甲)具有杀昆虫性。3、本发明的另外的方面是核酸序列，其包含编码上述任何实施例的多肽的编码序列。本发明的其他方面是以下核酸，其中编码序列包含与seq id no:13-28中的任一个具有至少80％同一性的核苷酸序列或者包含seq id no:13-28中的任一个；以下核酸，其中编码序列包含与seq id no:13-16中的任一个具有至少80％同一性的核苷酸序列或者包含seqid no:13-16中的任一个；以下核酸，其中编码序列包含seq id no:17-23中的任一个；以下核酸，其中编码序列包含seq id no:24-26中的任一个；以及以下核酸，其中编码序列包含seq id no:27或seq id no:28中的任一个。本发明的另一方面是以下这些核酸中的任一种，其中编码序列进行了密码子优化用于在植物中表达，并且其中该编码序列与异源启动子(例如，植物可表达型异源启动子)可操作地连接。4、本发明的仍另外的方面是包含任何所述核酸的载体以及包含任何所述多肽或任何所述核酸的转基因宿主细胞。本发明考虑了转基因宿主细胞，其中该转基因宿主细胞是植物细胞；其中该植物细胞是单子叶细胞；并且其中该植物细胞是玉蜀黍细胞。本发明的另外的方面是转基因宿主细胞，其中该转基因宿主细胞是细菌细胞。本发明考虑了转基因宿主细胞，其中这些细菌细胞是农杆菌属(agrobacterium)、芽孢杆菌属(bacillus)或大肠杆菌(escherichia coli)细胞。5、本发明的另外的方面是包含任何所述多肽的组合物以及进一步包含农业上可接受的运载体的所述多肽的组合物。本发明的仍另外的方面是包含任何所述多肽或包含任何所述核酸的植物。本发明考虑了这些植物是单子叶植物并且这些植物是玉蜀黍植物。本发明的另外的方面是任何所述植物的种子以及任何所述植物的细胞。6、本发明还提供产生转基因植物的方法，该方法包括以下步骤：将任何所述核酸引入植物细胞中，选择包含该核酸的植物细胞；以及从所选择的植物细胞再生植物。还提供了用于产生具有增强的杀昆虫特性的转基因植物的方法，该方法包括以下步骤：将第一亲本植物与第二亲本植物进行有性杂交，其中该第一或第二亲本植物是任何所述植物，以及选择具有增强的杀昆虫特性的第一代子代植物，其中所选择的子代植物包含核酸分子。本发明的另外的方面是产生具有增强的杀昆虫特性的转基因植物的方法，该方法进一步包括以下步骤：使所述第一代子代植物自交，从而产生多个第二代子代植物；以及从第二代子代植物中选择具有增强的杀昆虫特性的植物，其中所选择的第二代子代植物包含核酸分子。7、本发明还涉及控制鞘翅目有害生物的方法，这些方法包括将任何所述多肽递送至有害生物或其环境。在一些实施例中，鞘翅目有害生物是西方玉米根虫(玉米根萤叶甲)。这些方法的方面是在通过摄食递送多肽的情况下，并且另外的方面是在摄食包括有害生物摄食包含所述多肽的植物部分的情况下。本发明还考虑了seq id no:1至137中的任一个的序列在生物信息学分析中鉴定杀昆虫蛋白的用途以及包含seq id no:1-12或29-136中的任一个的氨基酸序列的多肽在昆虫生物测定中鉴定杀昆虫蛋白的用途(例如针对西方玉米根虫(玉米根萤叶甲)具有杀昆虫性)。8、对序列表中的序列的简述9、seq id no:1是itd-46的氨基酸序列。10、seq id no:2是假单胞菌属(pseudomonas)物种of001(itd-46直系同源物)的氨基酸序列。11、seq id no:3是甲烷八叠球菌科古细菌(methanosarcinaceae archaeon)itd-46直系同源物的氨基酸序列。12、seq id no:4是伯克霍尔德菌属(burkholderia)物种abcpw14(itd-46直系同源物)的氨基酸序列。13、seq id no:5是酸杆菌门(acidobacteria)细菌的itd-46直系同源物的氨基酸序列。14、seq id no:6是甲烷八叠球菌属(methanosarcina)物种mtp4(itd-46直系同源物)的氨基酸序列。15、seq id no:7是海南链霉菌(streptomyces hainanensis)的itd-46直系同源物的氨基酸序列。16、seq id no:8是itd-46_nterm_mod1的氨基酸序列。17、seq id no:9是itd-46_nterm_mod2的氨基酸序列。18、seq id no:10是itd-46_cterm_mod1的氨基酸序列。19、seq id no:11是甲烷八叠球菌科-itd-46嵌合体的氨基酸序列。20、seq id no:12是itd-46-甲烷八叠球菌科嵌合体的氨基酸序列。21、seq id no:13是假单胞菌属物种of001的核苷酸序列。22、seq id no:14是伯克霍尔德菌属物种abcpw14(itd-46直系同源物)的核苷酸序列。23、seq id no:15是甲烷八叠球菌属物种mtp4(itd-46直系同源物)的核苷酸序列。24、seq id no:16是海南链霉菌的itd-46直系同源物的核苷酸序列。25、seq id no:17是itd-46的大肠杆菌密码子优化的核苷酸序列。26、seq id no:18是假单胞菌属物种of001的大肠杆菌密码子优化的核苷酸序列。27、seq id no:19是甲烷八叠球菌科古细菌itd-46直系同源物的大肠杆菌密码子优化的核苷酸序列。28、seq id no:20是伯克霍尔德菌属物种abcpw14(itd-46直系同源物)的大肠杆菌密码子优化的核苷酸序列。29、seq id no:21是酸杆菌门细菌的itd-46直系同源物的大肠杆菌密码子优化的核苷酸序列。30、seq id no:22是甲烷八叠球菌属物种mtp4(itd-46直系同源物)的大肠杆菌密码子优化的核苷酸序列。31、seq id no:23是海南链霉菌的itd-46直系同源物的大肠杆菌密码子优化的核苷酸序列。32、seq id no:24是itd-46_nterm_mod1的大肠杆菌密码子优化的核苷酸序列。33、seq id no:25是itd-46_nterm_mod2的大肠杆菌密码子优化的核苷酸序列。34、seq id no:26是itd-46_cterm_mod1的大肠杆菌密码子优化的核苷酸序列。35、seq id no:27是甲烷八叠球菌科-itd-46嵌合体的大肠杆菌密码子优化的核苷酸序列。36、seq id no:28是itd-46-甲烷八叠球菌科嵌合体的大肠杆菌密码子优化的核苷酸序列。37、sed id no:29-135是itd-46丙氨酸扫描变体的氨基酸序列。38、seq id no:136是甲烷八叠球菌属物种dh2 nterm_固定变体的氨基酸序列。39、seq id no:137是甲烷八叠球菌属物种dh2 nterm_固定变体的大肠杆菌密码子优化的核苷酸序列。