一种肉桂精油对薏苡仁中黄曲霉的抑制方法

本发明涉及肉桂精油对黄曲霉的抑制机制及应用，具体为一种肉桂精油对薏苡仁中黄曲霉的抑制方法。背景技术：1、黄曲霉能产生有毒、致癌的黄曲霉毒素，造成严重的经济损失，对公众健康构成严重威胁。近年来，精油作为有前途的替代抗真菌剂而引起了人们的关注。本研究中，0.5μl/ml的肉桂精油（ceo）处理后，黄曲霉的菌丝生长、孢子萌发和黄曲霉毒素合成均被完全抑制。分析ceo治疗后的形态、生理和生化变化，以阐明抑制机制。转录组分析显示，ceo处理诱导了3,996个差异表达基因，其中一些涉及分生孢子梗发育、麦角甾醇合成、黄曲霉毒素生物合成和氧化应激的基因受到显着调节。此外，浓度为10.0µl/g的ceo可完全抑制薏苡仁中的黄曲霉感染。这项研究对ceo抗真菌机制的潜在过程提供了重要的启示，肯定了在食品保存中使用ceo作为绿色抗黄曲霉毒素生成剂的可能性，为此，我们提出一种肉桂精油对薏苡仁中黄曲霉的抑制方法。技术实现思路1、本发明的目的在于提供一种肉桂精油对薏苡仁中黄曲霉的抑制方法，以解决上述背景技术中提出的问题。2、为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：3、一种肉桂精油对薏苡仁中黄曲霉的抑制方法，其方法包括如下步骤，步骤一：肉桂精油提取：采用传统蒸馏与萃取结合的方法进行肉桂精油的提取，将桂皮清洗后阴干，用研钵磨碎成小块，称取20.0g桂皮及适量玻璃珠加入到蒸馏烧瓶内，加入250ml蒸馏水加热，煮沸6h后收集馏出液，馏出液中加入60ml二氯甲烷（dcm）混匀萃取，重复操作3次收集dcm溶液，加入无水cacl2脱水，抽滤，滤液加热蒸馏2h后收集烧瓶中澄清黄色液体即为肉桂精油，棕色瓶密封4℃储存，供分析使用；4、步骤二：黄曲霉毒素的提取及测定：取1ml浓度为0.0625、0.125、0.25、0.5μl/ml的肉桂精油加入装有29mlpdb培养基的三角瓶中，摇匀，对照组加入1ml的0.1%tween-80，向三角瓶中加入一定体积的黄曲霉孢子悬液，使其终浓度为1×106cfu/ml，在28℃、140rpm条件下震荡培养3d，吸取培养液，将培养液通过0.22μm有机滤膜滤过，80%色谱乙腈稀释后进行仪器分析检测毒素含量；5、步骤三：质膜分析：6、胞内蛋白渗漏7、采用不同浓度（0、0.125μl/ml、0.25μl/ml）ceo处理的黄曲霉菌丝体中渗漏蛋白的含量，采用培养液进行测定，通过bca蛋白测定试剂盒测定每个样品中的蛋白质含量；8、菌丝体麦角甾醇含量9、过滤收集菌丝体，用生理盐水冲洗3次，用滤纸吸去多余的水，称取湿菌丝体1g，加入5ml25%氢氧化钾-乙醇溶液，剧烈振荡5min，然后在85℃水浴中孵育，孵育4小时后，加入2ml无菌水和5ml正己烷，涡旋2分钟，然后，分离正己烷层并在紫外可见分光光度计（230～300nm）下检测，麦角甾醇（282nm）和脱氢麦角甾醇（282nm和230nm）的出现产生了特征吸收峰；10、步骤四：肉桂精油抑制黄曲霉生长和产生黄曲霉毒素作用机制： a.flavus菌种活化孢子悬液的制备，将黄曲霉菌株接种于pda综合培养基上，置于恒温恒湿培养箱中28℃、90%rh条件下培养5d，待平板长满菌丝且呈黄绿色时，在pda培养基上加入5ml的0.1%（v/v）tween-80，用移液器反复吹打，将孢子冲下并涡旋混匀，在显微镜下通过血球计数板（25×16）观察孢子并计数，孢子悬液在4℃冰箱保存，备用； 11、肉桂精油对 a.flavus孢子萌发影响 12、取2mlpdb培养基作为孢子生长的营养物质，在24孔细胞培养板中加入200μl1×107cfu/ml的孢子悬液，对照组中加入200μl0.1%tween-80，加入200μl不同浓度肉桂精油，使其终浓度为0.0625、0.125、0.25、0.5μl/ml，在恒温恒湿培养箱中28℃、90%rh条件下培养，分别在6h、9h、18h、24h、36h、48h、72h时利用倒置显微镜观察孢子生长及萌发情况，当芽管长度超过孢子直径一半时，视为孢子进入萌发阶段，直到对照完全萌发；13、步骤五：肉桂精油对 a.flavus菌丝生长的影响 14、制备精油抗性平板：在无菌培养皿中加入19mlpda培养基，趁热加入1ml不同浓度的肉桂精油，混匀，冷却，使其终浓度为0.0625、0.125、0.25、0.5μl/ml，在精油抗性平板中心接种10μl浓度为1×106cfu/ml孢子悬液，在28℃、90%rh条件下培养5d，采用十字交叉法测定菌落直径，最小抑菌浓度（mic）为抑制可见菌丝生长的最低肉桂精油浓度；15、肉桂精油对 a.flavus超微结构的影响 16、在pda综合培养基中加入不同浓度的肉桂精油，使其终浓度为0.0625、0.125、0.25、0.5μl/ml，以0.1%ttween-80的为对照组，在恒温恒湿培养相中28℃、90%rh条件下培养5d，从培养基上切下边长为3mm的正方体，浸泡在2.5%戊二醛中固定16h，固定前期要经常摇动，使用0.2mol/lpbs缓冲溶液清洗2次，15-20min/次，充分摇动；依次用浓度为50%、70%、80%、90%、95%、100%乙醇溶液进行洗脱，每个梯度浸泡2次，无水乙醇浸泡洗脱3次，洗脱时间15～20min；加入叔丁醇浸泡，37℃水浴加热，15～20min/次浸泡两次；冷冻干燥：液态浸泡的组织块置于专用器皿中，抽真空，制冷3～4h后粘贴，喷金，在10.0kv下用扫描电镜观察孢子和菌丝体形态特征；17、肉桂精油对黄曲霉毒素产生的影响18、取1ml浓度为0.0625、0.125、0.25、0.5μl/ml的肉桂精油加入装有29mlpdb培养基的三角瓶中，摇匀，对照组加入1ml的0.1%tween-80，向三角瓶中加入一定体积的黄曲霉孢子悬液，使其终浓度为1×106cfu/ml，在28℃、140rpm条件下震荡培养3d，吸取培养液，将培养液通过0.22μm有机滤膜滤过；19、步骤六：薏苡仁的灭菌与接种：薏苡仁在2%次氯酸中浸泡5min，晾干，称取10g大小均一的薏苡仁，平铺于已灭菌的扩散皿外环，准确吸取1ml a.flavus孢子悬液，接种到已灭菌处理的薏苡仁样品中，将1ml不同浓度的肉桂精油加入到扩散皿内环，快速盖好玻璃片，实验组的最终精油浓度为0、0.5、1、2、5、7.5、10、12、15和20µl/g，对照组中加入1ml0.1%tween-80，将实验组和对照组的培养皿均移入恒温恒湿培养箱中28c、90%相对湿度下培养15d，观察黄曲霉菌的生长情况，每个实验平行重复3次。待培养结束后，将实验组和对照组薏苡仁装入密封袋中，-20℃冰箱保存，备用； 20、步骤七：结果与分析：肉桂精油采用水蒸气蒸馏与有机溶剂萃取结合的方法进行提取，第一次蒸馏收集的馏出液体积为136ml，第二次蒸馏去除dcm后收集精油称重为0.631g，根据公式计算肉桂精油取率为3.155%，对肉桂精油进行gc-ms分析后可得到其总离子色谱图，据nist质谱库比对和文献中相应数据对化合物进行鉴定，肉桂精油中共鉴定出16种主要化合物，占化合物总量的99.64%，含量最丰富的化合物是肉桂醛（79.03%），其次是可巴烯（5.46%）、苯丙醛（2.7%）、乙酸肉桂酯（2.64%）、（+）-δ-杜松烯(1.97%)和2'-甲氧基肉桂醛(1.15%)，主要成分与wang等的结果一致，但与ganić等和minozzo等的研究结果不同，其报道了反式肉桂醛是肉桂精油的主要成分；21、肉桂精油对 a.flavus孢子萌发影响 22、显微镜下观察黄曲霉孢子的萌发状态，8h时对照组孢子完全萌发，结果表明，肉桂精油对黄曲霉孢子萌发具有抑制作用，且呈浓度依赖效应，随着肉桂精油浓度的增大，其对黄曲霉孢子萌发抑制率逐渐升高，当肉桂精油浓度为0.5μl/ml时，抑制率高达100%，从孢子形态观察及萌发抑制率测定结果可以发现，肉桂精油能显著抑制黄曲霉孢子萌发，推测可能是损伤dna从而达到对黄曲霉孢子萌发的抑制作用；23、肉桂精油对菌丝生长的影响24、抑菌圈直径大小可反映测试菌对精油的敏感程度，肉桂精油浓度与黄曲霉菌的生长呈负相关，即精油浓度越大，菌落直径越小，通过测量培养5d时菌丝的生长直径，得出肉桂精油对菌丝生长的抑制率，当肉桂精油浓度为0.0625μl/ml时菌落直径减少18.58%，当肉桂精油浓度为0.125μl/ml时菌落直径减少37.69%，当肉桂精油浓度为0.25μl/ml时菌落直径减少46.78%，当肉桂精油浓度为0.5μl/ml时完全抑制菌丝生长，继续培养到14d时依然没有菌落出现，说明肉桂精油对黄曲霉菌具有较强的抑菌活性，其mic和mfc为0.5μl/ml；25、肉桂精油对污染薏苡仁中黄曲霉的抑制作用26、肉桂精油对接种黄曲霉菌孢子悬液的薏苡仁的作用，随着肉桂精油浓度的不断增加，对薏苡仁中黄曲霉菌的抑制作用也逐渐增强，薏苡仁霉变最严重，表面附着一层厚厚的黄绿色霉菌；当精油浓度为1.0µl/g时，薏苡仁霉变情况较对照组有所减轻，但黄曲霉菌仍然较多；当精油浓度为2.5µl/g、5.0µl/g、7.5µl/g时，薏苡仁的霉变程度明显降低，随着肉桂精油浓度增加，薏苡仁表面的霉菌颜色由黑绿色转为白色；当精油浓度为10.0µl/g时，薏苡仁表面未观察到黄曲霉菌的生长。27、进一步的：所述步骤一中计算精油提取率：28、（4.1）29、注：w：精油提取率（%）；g1：精油质量（g）；g2：桂皮质量（g），采用agilenthp-5ms毛细管柱(30m×0.25mm,0.25μm)，气相色谱-质谱联用gcmsqp-2010ultra(shimadzu,kyoto,japan)分析ceo的化学成分，烘箱初始温度为40℃保持1min,10℃/min增加到120℃保持5min,5℃/min增加到230℃保持5min，最后230℃保持10min，载气为99.999%氦气，流速为1.0ml/min。在230℃下，以20:1的分流比将1µl的样品溶液注入进进样口。离子源温度为230℃，电子能量为70ev，质谱范围为30~450amu。30、进一步的：步骤三中通过bca蛋白测定试剂盒测定每个样品中的蛋白质含量。31、进一步的：步骤三中麦角甾醇含量的测定公式如下：（%）麦角甾醇=（a282/290）/菌丝体重量-（a230/518）/菌丝体重量其中290和518分别是麦角甾醇和脱氢麦角甾醇的e值。32、进一步的：步骤四每次镜检至少测定150个孢子，记录孢子萌发数，按公式计算孢子萌发率，得到不同作用时间下肉桂精油对黄曲霉孢子产生的抑制作用。33、进一步的：孢子萌发率公式为：34、。35、与现有技术相比，本发明的有益效果是：36、该肉桂精油对薏苡仁中黄曲霉的抑制方法，肉桂精油对黄曲霉的最低抑制浓度为0.5μl/ml，首次阐明了肉桂精油抗黄曲霉毒素产生作用的分子机制，肉桂精油对薏苡仁黄曲霉感染有显着的抑制作用；随着肉桂精油浓度的不断增加，对薏苡仁中黄曲霉菌的抑制作用也逐渐增强，薏苡仁霉变最严重，表面附着一层厚厚的黄绿色霉菌；当精油浓度为1.0µl/g时，薏苡仁霉变情况较对照组有所减轻，但黄曲霉菌仍然较多；当精油浓度为2.5µl/g、5.0µl/g、7.5µl/g时，薏苡仁的霉变程度明显降低，随着肉桂精油浓度增加，薏苡仁表面的霉菌颜色由黑绿色转为白色；当精油浓度为10.0µl/g时，薏苡仁表面未观察到黄曲霉菌的生长。