提高奶牛磷素利用效率的复合生物制剂、制备方

本技术涉及奶牛磷减排，尤其是涉及一种提高奶牛磷素利用效率的复合生物制剂、制备方法和应用。背景技术：1、磷是奶牛饲料中的重要组份，对奶牛骨骼生成、繁殖性能等代谢过程具有广泛作用。植酸是植物细胞壁和种子中磷的储存形式，广泛存在于植物食物中。饲料中的植酸磷对动物来说难以吸收，因为它会与钙、镁等矿物质结合形成难溶性盐并排泄。而水解后的植酸则变为无机磷形式，可被动物充分吸收利用。2、研究发现，奶牛体内参与饲料中植酸磷转化的肠道微生物主要是普雷沃特氏菌，双歧杆菌和谢瓦氏菌，上述微生物虽然可以分泌植酸酶来水解植酸，提高饲料磷的消化性，但他们在瘤胃中的比例和长期定植能力较差，无法长期定植于瘤胃上皮内。同时，直接饲喂植酸酶会较快地随着食糜排出体外，且其活性容易被消化道中的相关成分破坏，从而失去活性，因此也无法对饲料中的植酸进行持续转化。3、因此，构建一个可以长期在瘤胃中存在的植酸酶体系，可为奶牛饲料磷素减量、环境保护和节本增效提供重要支撑。技术实现思路1、为了解决现有技术的不足，本技术提供一种提高奶牛磷素利用效率的复合生物制剂，该复合生物制剂可在瘤胃中长期定植且可对植酸进行高效降解，为奶牛磷减排和饲料高效利用提供方案。2、为此，本技术第一方面提供了一种提高奶牛磷素利用效率的复合生物制剂，所述复合生物制剂包括丁酸羧菌、dna和连接有纳米氧化锌的植酸酶；所述丁酸羧菌、dna和连接有纳米氧化锌的植酸酶之间依次相连。3、本技术中，所述复合生物制剂包括通过dna相连的丁酸羧菌和连接有纳米氧化锌的植酸酶，丁酸羧菌在肠道中定植能力较强且抗逆性强(耐高温、耐酸碱、耐胆盐)，因此能使复合生物制剂在肠道内长期定植；植酸酶用于对植酸进行降解，将植酸水解为无机磷形式，进而可被动物充分吸收利用；纳米氧化锌为植酸酶保护剂，能够保护植酸酶的活性，进而对饲料中的植酸进行持续转化。与传统的植酸酶相比，该复合生物制剂在奶牛上的应用效应时间长，磷素减排效果好，因此能够较好地应用在降低奶牛养殖过程中的磷排放中。4、在一些实施方式中，所述dna为由模板和引物所形成的dna环；所述模板的核苷酸序列如seq id no:1(5’-tgtcttcgccttcttgtttcctttccttgaaacttcttcctttctttctttcgactaagcacc-3’)所示，所述引物的核苷酸序列如seq id no:2(5’-ggcgaagacaggtgcttagtc-3’)所示。5、本技术中，通过所述dna能够将丁酸羧菌和连接有纳米氧化锌的植酸酶进行连接，利用丁酸羧菌在肠道内的强定植性，使得连接在丁酸羧菌上的植酸酶能够在肠道内保留更长的时间，进而有效发挥水解植酸的作用。6、在一些实施方式中，所述丁酸羧菌为牛源丁酸梭菌。7、在一些具体实施例中，所述丁酸羧菌为牛粪源丁酸梭菌。本技术复合生物制剂中的丁酸羧菌选用牛源丁酸梭菌，因此不会产生生物安全性问题，且锌和植酸酶也均为常用的奶牛饲料添加剂，因此本技术的复合生物制剂能够作为饲料添加剂用于奶牛的饲养。8、本技术第二方面提供了一种如本技术第一方面所述的复合生物制剂的制备方法，所述方法包括如下步骤：9、s1，将所述模板和引物进行成环处理后，进行滚环扩增，获得dna环；10、s2，将所述引物与丁酸梭菌连接，合成引物-丁酸梭菌的连接体；11、s3，对包含所述dna环、引物-丁酸梭菌的连接体和连接有纳米氧化锌的植酸酶的反应体系进行连接反应，制得所述复合生物制剂。12、本技术通过上述方法整合形成了一个基于牛源丁酸梭菌-dna-纳米氧化锌-植酸酶的奶牛磷素高效利用的新型添加剂-复合生物制剂，该复合生物制剂可极大提升植酸酶在减少奶牛养殖过程中的磷过度排放问题。13、在一些实施方式中，所述步骤s1具体包括：将所述模板、引物与缓冲液混合后进行退火处理，制得模板/引物二聚体；将所述模板/引物二聚体与t4dna连接酶和t4dna连接酶缓冲液混成配制成交联体系，对所述交联体系进行交联反应后制得环化的模板/引物；对所述环化的模板/引物进行滚环扩增，制得dna环。14、本技术中，所述模板与引物的浓度比可以为(1～2):4，如1.5:4；缓冲液可以为1×pbs(磷酸缓冲液)；退火处理的退火温度可以为95～98℃，退火时间可以为1～3分钟。15、本技术中，交联体系的体积可以为20～25μl，交联体系中模板/引物二聚体的含量可以为1.5～2μm，t4dna连接酶的含量可以为25～30u/μl；交联反应的温度可以为15～18℃，时间可以为10～15小时。16、本技术中，滚环扩增的反应体系可以为60μl，反应体系中包括环化的模板/引物、dntps、dna聚合酶(phi29dna聚合酶)、dna聚合酶缓冲液(10×phi29dna聚合酶缓冲液)；滚环扩增的程序可以为：95～98℃预变性3～5min；90～94℃变性1～2min，55～60℃退火35～45s，70～72℃延伸40～45s(变性-退火-延伸，25个循环)；70～72℃再延伸40～45s终止。17、本技术通过上述方法可以有效制得dna环，用于后续步骤的使用。18、在一些实施方式中，所述步骤s2具体包括：采用1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺和n-羟基琥珀酰亚胺对丁酸梭菌进行活化处理，制得活化后的丁酸梭菌；将所述活化后的丁酸梭菌与所述引物混合后进行连接反应，制得引物-丁酸梭菌的连接体。19、本技术中，先采用活化剂1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺(edc)和n-羟基琥珀酰亚胺(nhs)对丁酸梭菌进行活化，使得丁酸梭菌表面上的羧基反应活性增强，进而高效与所述引物中的氨基进行偶联反应，使得引物与丁酸梭菌偶联，制得引物-丁酸梭菌的连接体。本技术中，所述连接反应可以在厌氧条件下进行，连接反应的温度为20～25℃，时间为2.5～3小时。20、在一些实施方式中，所述连接有纳米氧化锌的植酸酶的制备方法包括以下步骤：21、t1，将含氯化锌的甲醇溶液滴加至聚乙烯吡咯烷酮的甲醇溶液中后进行搅拌反应，获得锌-聚乙烯吡咯烷酮溶液；22、t2，将含植酸酶的甲醇溶液滴加至所述锌-聚乙烯吡咯烷酮溶液中后进行搅拌反应，对反应产物进行透析后，制得连接有纳米氧化锌的植酸酶。23、本技术通过上述方法可简单有效地将纳米氧化锌连接在植酸酶上，其中步骤t1中的搅拌反应可以为常温(20～25℃)条件下进行，搅拌转速为300～500rpm，时间为10～20分钟；步骤t2中的搅拌反应可以为常温(20～25℃)条件下进行，搅拌转速为300～500rpm，时间为2.5～3小时。24、在一些实施方式中，所述植酸酶、氯化锌和聚乙烯吡咯烷酮的质量比为1:(1.5～2.5):(6～7)。25、在一些优选的实施方式中，所述植酸酶、氯化锌和聚乙烯吡咯烷酮的质量比为1:2:6.6。26、本技术通过将植酸酶、氯化锌和聚乙烯吡咯烷酮的用量关系控制在上述范围内，能使制得的连接有纳米氧化锌的植酸酶中纳米氧化锌对植酸酶的保护效果更好，进而提高复合生物制剂对奶牛饲料中磷素利用效率的提升效果。27、在一些实施方式中，所述步骤s3具体包括：将所述dna环、引物-丁酸梭菌的连接体、连接有纳米氧化锌的植酸酶、dna聚合酶、dntps、dna聚合酶缓冲液和水混合，形成反应体系；将所述反应体系于25～30℃的厌氧环境下进行1.5～2.5小时的连接反应，制得所述复合生物制剂。28、本技术中，反应体系内添加的dna聚合酶可以为phi29dna聚合酶，dna聚合酶缓冲液可以为10×phi29dna聚合酶缓冲液。29、本技术中，所述方法采用的丁酸羧菌为牛源丁酸羧菌，具体为牛粪源丁酸羧菌，所述牛粪源丁酸羧菌可以通过对奶牛粪便进行分离和培养后制得。30、本技术第三方面提供了一种提升奶牛饲料中磷素利用效率的饲料添加剂，其包括如本技术第一方面所述的复合生物制剂或者第二方面所述方法制备的复合生物制剂。31、本技术的复合生物制剂中，连接有纳米氧化锌的植酸酶通过dna连接于在肠道内的强定植性的丁酸羧菌上，利用丁酸羧菌在肠道内的强定植性，使得连接在丁酸羧菌上的植酸酶能够在肠道内保留更长的时间，进而有效发挥水解植酸的作用，且纳米氧化锌能够保护植酸酶的活性，使定植在肠道内的植酸酶对饲料中的植酸进行持续转化，与传统的植酸酶相比，该复合生物制剂在奶牛上的应用效应时间长，磷素减排效果好，且复合生物制剂中的成份均具有生物安全性，因此能够较好地应用在提升奶牛饲料中磷素利用效率的饲料添加剂中。32、本技术的有益技术效果为：本技术所提供的复合生物制剂中丁酸羧菌在肠道中定植能力较强，因此能提高连接在丁酸羧菌上的植酸酶在肠道内的保留时间，进而有效发挥水解植酸的作用，且植酸酶上所连接的纳米氧化锌能够保护植酸酶的活性，使植酸酶对饲料中的植酸进行持续转化，因此该复合生物制剂在奶牛上的应用效应时间长，磷素减排效果好，且复合生物制剂中的成份均具有生物安全性，因此能够较好地应用在降低奶牛养殖过程中的磷排放中，应用前景良好。