SAE1蛋白抑制剂及SiRNA在制备治疗和/或预防肝内胆

本发明专利属于生物，涉及一种sae1的sirna及sae1蛋白抑制剂ml-792在肝内胆管癌治疗中的应用以及检测肿瘤组织中sae1基因在制备预测肝内胆管癌预后剂盒中的应用。背景技术：1、肝内胆管癌(intrahepatic cholangiocarcinoma，icc)是一种源自肝内胆管上皮细胞的肝恶性肿瘤，是原发性肝癌中第二常见的病理类型，其发病率仅次于肝细胞癌(hepatocellular carcinoma，hcc)，占所有原发性肝癌的10％至15％。近年来肝内胆管癌的诊疗方面取得了一些进展，但由于其存在高度侵袭性、高复发率以及易于远处转移的特点，肝内胆管癌仍然是一种预后不佳的致死性疾病。因此，筛选新的分子靶标对于更好地探索肝内胆管癌的发病机制并延缓肿瘤进展有至关重要的作用。2、sae1是sumo化过程中的关键酶之一，其与另一个亚基sae2共同组成sumo的e1激活酶，催化sumo的活化过程。sumo化过程是通过类似于蛋白质泛素化的酶级联催化过程进行的。sumo蛋白作为可逆的翻译后蛋白修饰剂，可共价连接至底物赖氨酸残基，以改变靶蛋白的分子表明修饰情况。这种改变可以影响靶标的蛋白质相互作用、活性和细胞定位。目前在几种恶性肿瘤中均观察到sumo水平的升高，并且其升高的状态与患者预后不良相关。3、sae1的表达水平在多种肿瘤中有改变的趋势，提示其可能参与肿瘤的发生和发展进程。例如，多项研究表明sae1在一些癌症类型中表达水平升高，包括肝细胞癌、乳腺癌、胃癌、胰腺癌和肺癌。因此，sae1是一个值得研究的蛋白，对其进行研究有助于更好地了解苏木化修饰过程及肿瘤发生发展机制。在肝细胞性肝癌中，sae1的表达已被证明与肿瘤分期、转移表型和生存率密切关系，表明sae1在肝细胞性肝癌中具有很好的诊断价值。功能上，sae1促进hcc细胞的增殖和侵袭，抑制细胞凋亡，而sae1的缺乏则会阻断肿瘤细胞周期。本发明人先前的研究发现环状rna circ-rapgef5可促进肝内胆管癌的发生发展，其促癌机制是通过调节sae1的稳定性实现。该发现提示sae1在肿瘤进展中存在重要的作用，可作为肝内胆管癌的肿瘤学生物标志物及治疗靶点。4、ml-792是一种特异性的小泛素样修饰物(sumo)活化酶(sae)抑制剂。ml-792通过在酶本身催化的atp依赖性机制中与sumo形成加合物来抑制sae活性，可选择性抑制sae/sumo1和sae/sumo2。5、然而，迄今为止，尚未见sae1的sirna及sae1蛋白抑制剂ml-792在肝内胆管癌治疗和疾病进展预测的应用中的相关研究和报道。技术实现思路1、本发明的目的在于提供一种sae1的sirna及sae1蛋白抑制剂ml-792在肝内胆管癌治疗中的应用。2、本发明的另一目的在于检测肿瘤组织中sae1基因在制备预测肝内胆管癌预后剂盒中的应用。3、本发明针对肝内胆管癌目前治疗效果极差，预后预测存在困难的特点，提供了一种通过靶向调控sae1来治疗肝内胆管癌的方法，具体涉及sae1的sirna及sae1蛋白抑制剂ml-792在制备逆转肝内胆管癌肿瘤的药物中的应用。4、同时，本发明也提供了一种可作为判断肝内胆管癌预后的生物标记sae1，其在组织中的表达情况可以反映肝内胆管癌的患者的预后情况，sae1在组织中高表达时预示肝内胆管癌患者预后不良。5、为了达到上述目的，本发明采用了以下技术方案：6、本发明人前期工作证实circ-rapgef5是肝内胆管癌中特异表达的环状rna，与肝内胆管癌预后显著相关。本发明通过对circ-rapgef5表达正常和表达下调的肝内胆管癌细胞系rbe、cclp1、9810进行二代测序，发现sae1在circ-rapgef5下调细胞中显著低表达。表明sae1可能是circ-rapgef5的下游效应分子。然后设计了sae1的表达抑制剂sirna，并将sirna转染至肝内胆管癌细胞系后，通过qrt-pcr检测的sirna对sae1的敲减效率。利用cck8实验、流式细胞术、transwell实验检测细胞转染前后细胞活力、细胞周期、细胞凋亡、迁移能力及侵袭能力的变化情况。明确sae1表达抑制后可逆转肝内胆管癌的进展。随后，本发明锚定一种sae1的抑制剂化合物ml-792，为一种选择性的sae/sumo抑制剂。本发明应用cck8实验及ic50分析确定的ml-792对肝内胆管癌细胞的半数抑制浓度，同时证明ml-792可有效抑制肝内胆管癌的进展。此外，在pdx荷瘤小鼠的动物模型中，检测在使用ml-792进行瘤周注射治疗下，pdx肿瘤体积及生长曲线，在临床前模型中证实ml-792可在体内逆转肝内胆管癌的进展。接下来，本发明通过检测肝内胆管癌患者临床肿瘤样本制成的组织芯片中sae1的表达量确定sae1的高表达与肝内胆管癌患者的预后不良有关，可通过检测sae1的表达水平以预测肝内胆管癌患者的预后。7、在上述研究的基础之上，本发明找到了一种肝内胆管癌特异性的生物标志物为sae1，所述的sae1生物标志物的ensembl编号如ensg00000142230。8、进一步的，本发明还提出了sae1的sirna及抑制剂ml-792在制备逆转肝内胆管癌逆转药物中的应用。所述的sae sirna包括si-sae1#1及si-sae1#2。si-sae1#1：cagaagatcccggagctca；si-sae1#2：cagggatgtcatagttaaa。9、所述的ml-792cas编号为1644342-14-2。10、其中，优选的，所述的肝内胆管癌包括肝内胆管癌细胞系及肝内胆管癌荷瘤小鼠。11、更优选的，肝内胆管癌细胞系为rbe、cclp1。12、在本发明所述的应用中，所述药物抑制sae1的表达及抑制sae1的活性从而达到治疗肝内胆管癌的目的。13、更进一步的，本发明还提出了用于检测所述sae1表达水平的试剂在制备肝内胆管癌患者疾病进展预测试剂中的应用。14、其中，优选的，所述用于检测sae1表达水平的试剂为引物，所述引物由上游引物和下游引物组成，优选的，上游引物序列为：cactcaattcgatgctgtgtgt；下游引物序列为：ccatggtagccaaaaacatctcc。15、其中，sae1的表达量与患者不良预后的发生成正相关。16、与现有技术相比，本发明具有的优点和有益效果：17、本发明首次发现的sae1生物标志物是一种全新的肝内胆管癌治疗及预后预测靶点，体外实验证实靶向并抑制sae1可以显著抑制肝内胆管癌细胞活力、增殖能力、迁移和侵袭能力。同时，sae1抑制剂ml-792能够发挥有效杀伤肝内胆管癌细胞的体内治疗效应，可应用于抗肿瘤药物的制备中。本发明为肝内胆管癌提供了新的治疗及预测靶点，具有重要的临床转化价值。技术特征：1.sae1蛋白抑制剂在制备治疗和/或预防肝内胆管癌药物中的应用。2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述sae1蛋白抑制剂为ml-792，其结构如下：3.一种sirna，其特征在于，其碱基序列如si-sae1#1或si-sae1#2所示：4.一种sae1基因的表达抑制剂，其特征在于，包括权利要求3所述的sirna。5.一种试剂盒，其特征在于，包括权利要求4所述的sae1基因的表达抑制剂。6.根据权利要求3所述的sirna在制备治疗和/或预防肝内胆管癌药物中的应用。7.检测sae1基因在肿瘤组织中的基因表达水平的试剂在制备预测肝内胆管癌预后剂盒中的应用，其特征在于，来自肝内胆管癌待测肿瘤组织的样品中sae1的水平越高，预示肝内胆管癌的恶性程度升高。8.检测sae1基因在肿瘤组织中的基因表达水平的试剂在制备预测肝内胆管癌预后剂盒中的应用。9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述的检测sae1基因在肿瘤组织中的基因表达水平的试剂，包括上游引物序列和下游引物序列：技术总结本发明公开了SAE1蛋白抑制剂及SiRNA在制备治疗和/或预防肝内胆管癌药物中的应用。检测SAE1基因在肿瘤组织中的基因表达水平的试剂在制备预测肝内胆管癌预后剂盒中的应用，来自肝内胆管癌待测肿瘤组织的样品中SAE1的水平越高，预示肝内胆管癌的恶性程度升高。本发明首次发现的SAE1生物标志物是一种全新的肝内胆管癌治疗及预后预测靶点，体外实验证实SAE1的SiRNA及蛋白抑制剂ML‑792可以显著抑制肝内胆管癌细胞活力、增殖能力、迁移和侵袭能力。同时，化合物ML‑792能够在体内有效发挥杀伤肝内胆管癌细胞并抑制肿瘤生长，可应用于抗肿瘤药物的制备中。技术研发人员：梁霄,郑俊浩,徐俊杰,王雅丽,陶力野,沈泽锋,谢阳阳,刘洋,李世豪,潘昊宇受保护的技术使用者：浙江大学技术研发日：技术公布日：2024/8/16