RIPK3的抑制剂及其在制备骨质疏松症和/或骨溶解

本发明属于生物技术和医学领域。本发明涉及ripk3的抑制剂及其在制备骨质疏松症和/或骨溶解症治疗药物中的应用，具体而言，本发明涉及ripk3激酶活性突变体及ripk3抑制剂在骨质疏松症、骨溶解症中的效应、作用机制、实施方法和用途。背景技术：1、骨质疏松症(osteoporosis，op)是以低骨量和骨组织微结构退化为特征，表现为骨脆性增加，骨折风险升高的全身性骨骼疾病。2、骨溶解症(osteolysis,ol)是在关节置换手术常见的并发症。随着全球老龄化增加，关节疾病手术频率也逐年上升[1]。然而全关节置换后，由于接触表面磨损或腐蚀会逐渐产生磨损颗粒，从而使假体周围发生骨质溶解和无菌性松动，最终导致手术失败[2]。3、op以及ol是由破骨细胞(osteoclast,oc)主导的骨吸收能力超过了成骨细胞主导的骨形成能力，造成骨代谢失衡引起的[3]。目前绝经后op发生的主要原因是雌激素的缺乏导致无法抑制oc凋亡[4]，而凋亡则属于程序性细胞死亡(programmed cell death,pcd)之一。pcd是涉及复杂级联信号介导的细胞死亡过程，包括凋亡、焦亡、铁死亡以及程序性坏死等，能够决定骨组织细胞命运，是参与骨代谢稳态调节的新途径[5]。程序性坏死是近年来发现的一种新型pcd方式[6]，通过炎症因子tnf-α诱导将受体相关蛋白激酶(receptor-interacting serine/threonine protein kinase 1/3,ripk1/3)死亡信号分子传递至胞内，促进炎症介质释放进而引发组织细胞坏死性凋亡并参与多种疾病的发生发展[7]。4、程序性坏死虽因刺激方式不同存在多种受体信号偶联，但最终都会激活ripk3调控细胞死亡过程。与ripk1不同，ripk3作为直接介导程序性坏死信号传导中的核心分子[8]，通过与ripk1或其他含有受体相关蛋白激酶同型结构域(receptor-interacting proteinkinase homotypic interaction motif,rhim)的蛋白(如trif和dai)相互作用被激活，随后抑制caspase8活化，ripk1和ripk3互相磷酸化激活，导致坏死小体活化，激活下游mlkl蛋白，使得mlkl异位到细胞膜上引起坏死，同时通过损伤相关分子模式(damage-associatedmolecular patterns,damps)释放il-1α等炎性介质[9]。近年来随着研究的深入，发现ripk3在不诱发程序性坏死的情况下(即不激活mlkl)也能够对炎症信号与免疫功能发挥调控作用[10,11]。比如发明专利“一种靶向抑制人与鼠ripk3蛋白激酶活性的小分子化合物”(cn115650956a)中指出了一种小分子化合物可以通过抑制ripk3激酶活性，阻止mlkl磷酸化，从而改善炎症和肿瘤，该专利对抑制ripk3激酶活性在治疗炎症相关性结直肠癌中的用途进行了保护。同时，另一ripk3的抑制剂zharp-99作为激酶活性抑制剂在程序性坏死以及炎症性疾病中作用已被证实[12]。5、目前，治疗op的药物研发已取得突破性进展，但仍缺乏足够安全且有效的药物，如双磷酸盐会加重肾脏负担；地舒单抗停药后的“反弹效应”；罗莫珠单抗长期用药有心血管风险等。同时，颗粒磨损导致的ol也因为手术难度高而难以治疗。因此，深入探索op及ol的发病机制并寻找最佳的治疗靶点具有重要的临床意义。6、在癌症、慢性炎症性疾病以及血液系统等多种疾病中ripk3作为影响疾病进程的关键靶点发挥了重要作用，其表达水平的变化可以通过信号传导对疾病进展的进行调控。但是ripk3激酶活性突变体及ripk3抑制剂在oc分化以及op、ol等疾病中的功能及应用前景仍不清楚。7、事实上，ripk3经典激酶功能便是对人类mlkl蛋白中357位苏氨酸、358位丝氨酸、345位丝氨酸和347位丝氨酸处的磷酸化，进而促进坏死小体形成。然而，mlkl不是ripk3的唯一底物[13]。ripk3在能量代谢中也有参与磷酸化线粒体相关代谢酶，从而增加有氧呼吸[14]。ripk3对于oc的调控信号是否通过mlkl来介导、ripk3抑制物(如sirna、shrna、sgrna等)在调控op及ol疾病中的作用，目前尚不明确。8、已有研究报道，ripk3可与天冬氨酸水解酶caspase8互作结合，激活下游多条信号通路[15]。其中，nf-κb信号通路与oc分化密切相关[16]。nf-κb信号根据作用机制可分为经典与非经典信号通路，二者均在oc分化中起重要作用[17]。相较于经典nf-κb信号，非经典信号通路更多对慢性炎症发挥调控作用，这与op、ol等骨量丢失病理过程及oc分化相吻合[18]。nf-κb诱导激酶(nf-κb inducing kinase,nik)作为非经典信号通路中关键“分子开关”，是否与ripk3存在密切相互作用，进而对oc分化调控，亦尚无定论。9、引用文献10、[1]collins nj,roos em.patient-reported outcomes for total hip andknee arthroplasty:commonly used instruments and attributes of a"good"measure.clin geriatr med.2012aug；28(3):367-94.11、[2]kurtz sm,ong kl,lau e,bozic kj.impact of the economic downturn ontotal joint replacement demand in the united states:updated projections to2021.j bone joint surg am.2014apr 16；96(8):624-30.12、[3]w.yu,l.zhong,l.yao,y.wei,t.gui,z.li,h.kim,n.holdreith,x.jiang,w.tong,n.dyment,x.s.liu,s.yang,y.choi,j.ahn,l.qin,bone marrow adipogeniclineage precursors promote osteoclastogenesis in bone remodeling andpathologic bone loss,j clin invest,131(2021).13、[4]t.nakamura,y.imai,t.matsumoto,s.sato,k.takeuchi,k.igarashi,y.harada,y.azuma,a.krust,y.yamamoto,h.nishina,s.takeda,h.takayanagi,d.metzger,j.kanno,k.takaoka,t.j.martin,p.chambon,s.kato,estrogen preventsbone loss via estrogen receptor alpha and induction of fas ligand inosteoclasts,cell,130(2007)811-823.14、[5]z.c.li,d.d.li,r.c.chen,s.gao,z.w.xu,n.h.li,cell death regulation:anew way for natural products to treat osteoporosis,pharmacol res,187(2023).15、[6]l.mifflin,d.ofengeim,j.yuan,receptor-interacting protein kinase 1(ripk1)as a therapeutic target,nat rev drug discov,19(2020)553-571.16、[7]r.weinlich,a.oberst,h.m.beere,d.r.green,necroptosis indevelopment,inflammation and disease,nat rev mol cell biol,18(2017)127-136.17、[8]m.feng,r.zhang,f.gong,p.yang,l.fan,j.ni,w.bi,y.zhang,c.wang,k.wang,protective effects of necrostatin-1on glucocorticoid-inducedosteoporosis in rats,j steroid biochem mol biol,144pt b(2014)455-462.18、[9]b.he,y.zhu,h.cui,b.sun,t.su,p.wen,comparison of necroptosis withapoptosis for ovx-induced osteoporosis,front mol biosci,8(2021)790613.19、[10]j.chen,j.q.liang,y.f.zhen,l.chang,z.t.zhou,x.j.shen,dcaf1-targeting microrna-3175activates nrf2 signaling and inhibits dexamethasone-induced oxidative injury in human osteoblasts,cell death dis,12(2021)1024.20、[11]j.q.liang,z.t.zhou,l.bo,h.n.tan,j.h.hu,m.s.tan,phosphoglyceratekinase 1silencing by a novel microrna microrna-4523protects human osteoblastsfrom dexamethasone through activation of nrf2 signaling cascade,cell deathdis,12(2021)964.21、[12]xia k,zhu f,yang c,wu s,lin y,ma h,yu x,zhao c,ji y,ge w,wang j,du y,zhang w,yang t,zhang x,he s.discovery of a potent ripk3 inhibitor forthe amelioration of necroptosis-associated inflammatory injury.front cell devbiol.2020dec 8；8:606119.22、[13]morgan mj,kim ys.roles of ripk3 in necroptosis,cell signaling,anddisease.exp mol med.2022oct；54(10):1695-1704.23、[14]yang z,wang y,zhang y,he x,zhong cq,ni h,chen x,liang y,wu j,zhaos,zhou d,han j.rip3 targets pyruvate dehydrogenase complex to increaseaerobic respiration in tnf-induced necroptosis.nat cell biol.2018feb；20(2):186-197.24、[15]boyle wj,simonet ws,lacey dl.osteoclast differentiation andactivation.nature.2003may15；423(6937):337-42.25、[16]jiang t,xia t,qiao f,wang n,jiang y,xin h.role and regulation oftranscript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