一种利用大肠杆菌胞外多糖抗生物膜的方法

本发明涉及抗菌。更具体地，涉及一种利用大肠杆菌胞外多糖抗生物膜的方法。背景技术：1、目前，细菌感染严重威胁着人类的生命安全健康，除了众所周知的微生物耐药性问题，微生物生物膜是当前临床感染难以根治的重要原因。自然界中仅有低于1％的微生物以浮游状态存在，生物膜是微生物的主要存在形式。目前，65-80％感染相关的疾病与生物膜有关。在疾病治疗时发现，微生物生物膜对抗菌剂的抵抗力是浮游微生物的100-1000倍，主要原因是生物膜胞外基质的存在，生物膜内的细菌被胞外基质包裹，因而可以躲避抗菌剂的杀灭以及免疫系统的识别。2、在自然界及临床上，微生物生物膜以多种细菌共同存在的共生生物膜形式为主。微生物间利用胞外多糖和自诱导物等作为信号分子进行种间或种内的交流，其中胞外多糖通过与微生物或哺乳动物细胞表面的凝集素结合从而介导细胞黏附。胞外多糖作为微生物繁殖、生长的重要调节因子以及生物膜组成的主要成分，其在细胞间以及细胞与表面之间的相互作用中起了重要作用。目前已经有研究表明有多种细菌的胞外多糖可以抑制异种细菌生物膜的形成，并且对细菌的生长无抑制作用。大肠杆菌作为一种常见的共生菌，在肠道内与多种细菌相互作用，与多种细菌在生物膜中竞争交流，因此使用大肠杆菌的胞外多糖有希望成为治疗生物膜的新方法。3、抗生素依然是目前临床上针对细菌感染的最普遍的治疗方法，然而抗生素的广泛使用会造成微生物产生耐药性，因此提高微生物对抗生素的敏感性是目前亟需解决的问题。如果可以将大肠杆菌的胞外多糖与抗生素联合使用，用以提高生物膜内微生物对抗生素的敏感性以及改善微生物的耐药性，这将为微生物生物膜的治疗提供新思路。技术实现思路1、本发明的目的在于提供一种利用大肠杆菌胞外多糖抗生物膜的方法。该方法可有效预防细菌生物膜的形成以及分散已经成熟的生物膜，同时在联合使用抗生素后，可以增强抗生素对成熟生物膜的治疗效果。2、为达到上述目的，本发明采用下述技术方案：3、本发明公开一种利用大肠杆菌胞外多糖抗生物膜的方法，该方法利用大肠杆菌胞外多糖抑制细菌生物膜的形成以减少生物膜形成总量；以及4、分散细菌成熟生物膜以减少已经成熟的生物膜的原有总量；5、其中，所述大肠杆菌胞外多糖由以下摩尔百分数的单糖组成：甘露糖26.79％、半乳糖21.42％、葡萄糖醛酸15.71％、核糖14.65％、葡萄糖14.20％、阿拉伯糖4.63％、岩藻糖1.15％、木糖0.83％，其余为半乳糖醛酸。6、进一步，所述细菌选自金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、大肠杆菌中的一种多种。7、进一步，所述大肠杆菌胞外多糖按照如下步骤制备得到：8、将大肠杆菌置于培养基进行扩增培养，离心，取上清液；9、将上清液进行醇沉、离心，收集沉淀物，将沉淀物用tris-hcl重悬并加入蛋白酶k进行孵育，孵育结束后进行醇沉、离心，收集沉淀物，将沉淀物用超纯水重悬并进行透析，对透析液进行冻干，得到所述大肠杆菌胞外多糖。10、进一步，所述培养基选自lb培养基。11、进一步，所述大肠杆菌选自大肠杆菌atcc 25922。12、进一步，所述醇沉采用的是无水乙醇，醇沉倍数为3-5倍。13、进一步，所述扩增培养为在37℃下培养18-24h。14、进一步，所述离心的条件为在8000-10000×g和4-5℃下，离心15-20min。15、进一步，使用8000-14000kda的透析袋透析进行2-3天。16、进一步，所述抑制细菌生物膜的形成是将含大肠杆菌胞外多糖的pbs与细菌菌悬液混合后培养24-48h；其中，含大肠杆菌胞外多糖的pbs与细菌菌悬液按照体积比为1:1进行混合；17、所述分散细菌成熟生物膜是根据孔板或基底大小将100μl-2ml细菌菌悬液培养24-48h后，弃去培养菌液，然后加入含大肠杆菌胞外多糖的pbs孵育2-12h。18、进一步，所述方法还包括联合利用大肠杆菌胞外多糖和抗生素来抑制细菌生物膜的形成和分散细菌成熟生物膜。19、进一步，所述抑制细菌生物膜的形成是将含大肠杆菌胞外多糖和抗生素的pbs与细菌菌悬液混合后培养24-48h；其中，含大肠杆菌胞外多糖和抗生素的pbs与细菌菌悬液按照体积比为1:1进行混合；20、所述分散细菌成熟生物膜是根据孔板或基底大小将100μl-2ml细菌菌悬液培养24-48h后，弃去培养菌液，然后加入含大肠杆菌胞外多糖和抗生素的pbs孵育2-12h；或者是将细菌菌悬液培养24-48h后，弃去培养菌液，然后加入含大肠杆菌胞外多糖的pbs孵育2-12h，弃去含大肠杆菌胞外多糖的pbs后加入含抗生素的pbs继续孵育2-12h。21、进一步，所述细菌菌悬液的浓度为107cfu/ml；22、所述含大肠杆菌胞外多糖的pbs的浓度为1-200μg/ml。23、进一步，所述含大肠杆菌胞外多糖和抗生素的pbs中大肠杆菌胞外多糖的浓度为1-200μg/ml。24、进一步，当抑制细菌生物膜形成时，所述含大肠杆菌胞外多糖和抗生素的pbs中抗生素的浓度为0.5-2mic；25、当分散细菌成熟生物膜时，所述含大肠杆菌胞外多糖和抗生素的pbs中抗生素的浓度为32-128mic；所述含抗生素的pbs的浓度为32-128mic。26、本发明的有益效果如下：27、本发明使用无杀菌能力但对生物膜有显著抑制效果的大肠杆菌胞外多糖来抑制细菌生物膜的形成以及分散细菌成熟生物膜，展现出优异的抗生物膜效果，同时，将大肠杆菌胞外多糖与临床上广泛使用的抗生素联合使用，可以增强抗生素对成熟生物膜的治疗效果。28、大肠杆菌胞外多糖可以通过阻止细菌间以及细菌与表面的黏附从而抑制细菌生物膜的形成，并且作用靶点凝集素广泛存在于各种生命体中，因此胞外多糖的抗生物膜作用具有一定普适性。再加上大肠杆菌胞外多糖可以分散成熟生物膜，使抗生素可以更好地治疗细菌感染，降低了抗生素的使用浓度，一定程度上克服了耐药性的问题。29、对于妥布霉素这类抗生素而言，在低浓度下会出现促进细菌生物膜形成的现象，将妥布霉素与大肠杆菌胞外多糖联合使用后，发现可以逆转妥布霉素在生物膜形成阶段导致生物膜量增加的问题，使其可以在使用相同浓度的抗生素时，可以使成熟生物膜量及细菌数量显著下降。技术特征：1.一种利用大肠杆菌胞外多糖抗生物膜的方法，其特征在于，利用大肠杆菌胞外多糖抑制细菌生物膜的形成以减少生物膜形成总量；以及2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述细菌选自金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、大肠杆菌中的一种多种。3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述大肠杆菌胞外多糖按照如下步骤制备得到：4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述大肠杆菌选自大肠杆菌atcc 25922。5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述抑制细菌生物膜的形成是将含大肠杆菌胞外多糖的pbs与细菌菌悬液混合后培养24-48h；6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法还包括联合利用大肠杆菌胞外多糖和抗生素来抑制细菌生物膜的形成和分散细菌成熟生物膜。7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述抑制细菌生物膜的形成是将含大肠杆菌胞外多糖和抗生素的pbs与细菌菌悬液混合后培养24-48h；8.根据权利要求5或7所述的方法，其特征在于，所述细菌菌悬液的浓度为107cfu/ml；9.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述含大肠杆菌胞外多糖和抗生素的pbs中大肠杆菌胞外多糖的浓度为1-200μg/ml。10.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，当抑制细菌生物膜形成时，所述含大肠杆菌胞外多糖和抗生素的pbs中抗生素的浓度为0.5-2mic；技术总结本发明公开一种利用大肠杆菌胞外多糖抗生物膜的方法。所述方法是利用大肠杆菌胞外多糖抑制细菌生物膜的形成以减少生物膜形成总量；以及分散细菌成熟生物膜以减少已经成熟的生物膜的原有总量；其中，所述大肠杆菌胞外多糖由以下摩尔百分数的单糖组成：甘露糖26.79％、半乳糖21.42％、葡萄糖醛酸15.71％、核糖14.65％、葡萄糖14.20％、阿拉伯糖4.63％、岩藻糖1.15％、木糖0.83％，其余为半乳糖醛酸。在该方法中，大肠杆菌胞外多糖可以预防细菌生物膜形成和分散成熟生物膜，联合使用抗生素后可以增强抗生素对细菌生物膜的治疗效果。技术研发人员：牛忠伟,万晨潇,田野受保护的技术使用者：中国科学院理化技术研究所技术研发日：技术公布日：2024/8/16