一种以非洲猪瘟病毒E165R蛋白为靶点的小分子化合

本发明属于抗病毒药物领域，具体涉及一种以非洲猪瘟病毒e165r蛋白为靶点的小分子化合物z3015156820在制备抗非洲猪瘟病毒药物中的应用。背景技术：1、非洲猪瘟（african swine fever, asf）是由非洲猪瘟病毒（asfv）感染引起的一种以猪发热和全身脏器出血为特征的急性烈性传染病。非洲猪瘟是世界动物卫生组织（oie）要求法定报告动物疫病。我国动物病原微生物名录将其列为一类病。2、asf于20世纪50年代传入欧洲，整个欧洲用了40年消除该病。然而，该病自2007年再次从东非传入格鲁吉亚，并迅速扩散至东欧国家，并于2017年传入俄罗斯远东地区。2018年8月，非洲猪瘟在我国沈阳首次发现，短短一年内，该病蔓延至全国30个省市自治区，给我国养猪业带来了巨大打击。由于至今仍无疫苗和特效治疗药物，非洲猪瘟疫情一旦发生，只能通过扑杀手段进行控制，但是这种方式不仅导致经济损失，而且无法满足我国规模化养猪的需要。因此，如何有效控制asf疫情是目前世界养猪业面临的巨大挑战之一，也是我国asf防控急需解决的重大难题。3、e165r蛋白是由asfv编码的，发挥三磷酸脱氧尿苷酶（dutpase）功能的非结构蛋白，该蛋白能有效降低脱氧尿苷浓度并为胸腺苷合成酶提供底物，进而确保病毒复制过程中dna的完整性。由于dutpase主要存在于活跃分裂和分化的细胞中，而asfv主要感染的猪巨噬细胞是静息细胞并没有dutpase。因此，asfv必须依赖自身编码的 e165r来保证在猪巨噬细胞内的正常复制。e165r蛋白是一种同源三聚体dutpase，包含五个高度保守的基序，这些基序表现出具有特定焦磷酸酶活性的活性酶促位点。除此之外，e165r还含有独特的双亚基活性位点，对高温具有极高的耐受性。细胞高通量筛选是寻找抗asfv药物的常见手段。该方法虽然准确率高，但成本较为昂贵，且筛选出的化合物靶向机制不明确，可能对宿主蛋白具有副作用。直接靶向病毒的化合物往往是病毒特异性的，主要通过直接作用于病毒蛋白或病毒基因组来发挥抗病毒效果。但目前针对非洲猪瘟病毒e165r蛋白的药物研究并不常见。有文献报道，根据asfv e165r蛋白的活性位点设计的化合物，在细胞水平上抑制asfv复制效果并不理想。因此，寻找可在细胞上抑制asfv复制的靶向e165r的化合物更具有意义。 技术实现思路1、针对现有技术中所存在的问题，本发明的目的在于提供一种以非洲猪瘟病毒e165r蛋白为靶点的小分子化合物z3015156820（iupac名称：3-[2-(2-tert-butylphenoxy)pyridin-3-yl]-1-[5-(4-phenyl-4h-1,2,4-triazol-3-yl)pyridin-2-yl]urea）在制备抗非洲猪瘟病毒药物中的应用。本发明利用计算机辅助药物设计中的虚拟筛选技术，针对asfv e165r蛋白晶体结构的解析，筛选到与靶标蛋白具有潜在抑制作用的小分子化合物。利用人工表达的asfv e165r蛋白，借助表面等离子共振实验（spr）鉴定小分子化合物与靶蛋白的亲和力常数；通过cck-8试剂盒检验小分子化合物z3015156820的细胞毒性；借助荧光定量pcr、免疫荧光实验及western blot实验检测其抑制病毒感染的活性，结果表明可显著抑制asfv的感染。2、为了实现上述目的及其他相关目的，本发明采用如下技术方案：3、本发明的第一方面，提供一种以非洲猪瘟病毒e165r蛋白为靶点的小分子化合物z3015156820在制备抗非洲猪瘟病毒药物中的应用，该小分子化合物z3015156820是从enamine advanced药物数据库中筛选出的小分子化合物，分子量505.57，分子式是c29h27n7o2，分子结构式为：4、。5、本发明的第二方面，提供了前述小分子化合物z3015156820的筛选方法是，以蛋白质结构库中非洲猪瘟病毒e165r（pdb id: 6lj3）作为对接受体，autodock vina软件对enamine advanced药物数据库中448388个化合物进行筛选的具体步骤如下：整合enamineadvanced数据库化合物格式；根据e165r活性位点设置盒子（box）中心位置（x轴：-9.695，y轴：14.741，z轴：-7.291），盒子大小设置为26 å×26 å×26 å；去除e165r水分子、配体等，将结构导入结合位点文件，在autodock vina软件下进行对接，筛选e165r抑制剂。6、本发明的第三方面，提供了一种虚拟筛选后，利用表面等离子共振技术对e165r抑制剂进行第二轮筛选验证的方法，方法是利用biacore技术分析小分子化合物与偶联于传感器芯片的重组asfv e165r蛋白之间的结合情况，证明小分子化合物z423747092可直接与偶联在芯片上的e165r结合，亲和力较高。7、本发明的第四方面，提供了小分子化合物z3015156820在制备抗非洲猪瘟病毒药物中的应用。8、在一些优选的实施方案中所述抗非洲猪瘟病毒药物可以为片剂、喷雾剂、颗粒剂、胶囊剂、口服液、针剂、混悬液的任一种。9、进一步地，所述非洲猪瘟病毒为基因ⅱ型非洲猪瘟病毒。10、进一步地，所述小分子化合物的浓度为12.5~200 μm。11、进一步地，所述小分子化合物的浓度为12.5~200 μm。12、进一步地，所述小分子化合物用于抑制非洲猪瘟病毒感染的活性。13、进一步地，所述小分子化合物用于抑制asfv p30、p72及e165r蛋白的表达。14、进一步地，编码所述e165r蛋白的引物序列如seq id no：1和seq id no：2所示。15、进一步地，所述药物还包括药学上可接受的载体。16、进一步地，所述药学上可接受的载体包括赋形剂、助流剂、稀释剂、防腐剂、着色剂、矫味剂、润湿剂、助悬剂、稳定剂、等渗剂、溶剂、乳化剂中的至少一种。17、进一步地，所述药物还包括赋形剂，所述赋形剂选自固体赋形剂、液体或半固体赋形剂。18、有益效果19、本发明基于asfv e165r蛋白晶体结构，通过虚拟筛选技术，获得了与asfv e165r特异性结合的小分子化合物z3015156820。通过表面等离子共振检测，化合物z3015156820与asfv e165r具备较高的亲和力。所述小分子化合物在细胞水平上病毒抑制效果显著。进一步通过后续体外活性实验，对所述小分子化合物进行进一步的生物活性验证，结果表明，小分子化合物z3015156820在12.5~200 μm浓度下均对asfv有显著抑制作用，且对感染pam细胞的asfv p30、p72及e165r蛋白表达具有显著抑制效果。技术特征：1.一种以非洲猪瘟病毒e165r蛋白为靶点的小分子化合物在制备抗非洲猪瘟病毒药物中的应用，所述的小分子化合物分子式是c29h27n7o2，结构式为：2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述非洲猪瘟病毒为基因ⅱ型非洲猪瘟病毒。3. 根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述小分子化合物的浓度为12.5~200 μm。4. 根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述小分子化合物的浓度为12.5~200 μm。5.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述小分子化合物用于抑制非洲猪瘟病毒感染的活性。6. 根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述小分子化合物用于抑制asfv p30、p72及e165r蛋白的表达。7.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述药物还包括药学上可接受的载体。8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述药学上可接受的载体包括赋形剂、助流剂、稀释剂、防腐剂、着色剂、矫味剂、润湿剂、助悬剂、稳定剂、等渗剂、溶剂、乳化剂中的至少一种。9.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述药物的剂型选自片剂、喷雾剂、颗粒剂、胶囊剂、口服液、针剂、混悬液的任一种。10. 根据权利要求1所述的应用，其特征在于，编码所述e165r蛋白的引物序列如seqid no：1和seq id no：2所示。技术总结本发明属于抗病毒药物领域，公开了一种以非洲猪瘟病毒E165R蛋白为靶点的小分子化合物的应用。本发明利用人工表达的ASFV E165R蛋白，借助表面等离子共振实验（SPR）鉴定小分子化合物与靶蛋白的亲和力常数；通过CCK‑8试剂盒检验小分子化合物Z3015156820的细胞毒性；借助荧光定量PCR、免疫荧光实验及Western blot实验检测其抑制病毒感染的活性，结果表明可显著抑制ASFV的感染。技术研发人员：焦新安,潘志明,黄霞,康喜龙,孟闯,顾丹受保护的技术使用者：扬州大学技术研发日：技术公布日：2024/8/16