一种新型联合佐剂流感疫苗及其制备方法和应用

本发明属于生物，涉及一种新型联合佐剂流感疫苗及其制备方法和应用。背景技术：1、流行性感冒病毒，属正粘病毒科的代表，简称流感病毒，流感病毒形态呈球形，少数呈丝状，其直径在80至120纳米之间，流感病毒结构自外而内可分为包膜、基质蛋白以及核心三部分。2、国家统计局数据显示中国在迅速进入老龄化，2020年有1.9064亿名65岁及以上老年人占国家总人口数的13.1％，2022年有2.1035亿名65岁及以上老年人占国家总人口数的14.9％，预计在2030年老龄人口占比将达到26％(3.64亿)。流感病毒感染风险严重的特定群体包括孕妇，小于5岁的儿童，大于65岁的老年人和有潜在基础病如心脏病、哮喘、糖尿病的个体。研究显示，由流感造成的呼吸系统疾病的超额死亡率为12.4/10万，由流感造成的循环系统疾病的超额死亡率为8.8/10万，其中86％发生在65岁及以上的人群中。3、我国老年人群疫苗接种率普遍偏低，且老年人群疫苗免疫后产生的流感病毒特异性抗体水平较18～60岁的成年人低。免疫衰老成为针对60岁及以上老年人群开发新的或更有效的流感病毒疫苗的主要挑战。目前国外已上市的针对60周岁以上的老年流感疫苗主要以添加佐剂或者提高抗原剂量来提高疫苗接种后的保护率。国内大多数主流流感疫苗的使用范围是3岁及以上成年人，但是针对60周岁以上的老年流感疫苗，国内流感疫苗企业暂未有单独获批上市的。4、目前流感疫苗佐剂研究大概集中在铝佐剂、乳剂、细胞因子佐剂、病毒载体佐剂、脂质体佐剂和天然多糖佐剂。5、铝佐剂是当前应用时间最长的一类佐剂，其作用机制相对明确。使用最多的是氢氧化铝佐剂，抗原主要通过静电作用吸附在铝佐剂表面，增强抗原的稳定性，促进抗原被抗原提成细胞摄取和提呈以及th2细胞介导的b细胞应答，同时招募中性粒细胞、dc和嗜酸性粒细胞到注射部位，引起固有免疫。6、cpg佐剂是一种22聚体非甲基化的cpg-b类寡核苷酸，可刺激b细胞和nk细胞活化。cpg-b定位于转铁蛋白受体1(tfr1)内体，并通过tlr9依赖性机制导致ifna的产生。用可溶性cpg-b加抗原免疫，通过依赖于dc中tlr9介导的myd88激活的机制，诱导激活nf-kb产生促炎性和th1型的细胞因子。7、因此，亟需一种新型联合佐剂流感疫苗，突破现有单一佐剂组分，以提高疫苗对60岁以上老年人群的免疫效果。技术实现思路1、针对现有技术的不足和实际需求，本发明提供一种新型联合佐剂流感疫苗及其制备方法和应用，新型联合佐剂流感疫苗中的开链三萜类化合物、吐温80、乳化剂、cpg佐剂和铝佐剂在提高流感疫苗的保护效果，诱导更高的免疫方面具有协同功效，有效降低了抗原使用量，能够显著提高流感疫苗对60岁以上老年人群的免疫效果。2、为达到此发明目的，本发明采用以下技术方案：3、第一方面，本发明提供了一种新型联合佐剂流感疫苗，所述新型联合佐剂流感疫苗包括：含有甲型流感病毒血凝素的单价原液、含有乙型流感病毒血凝素的单价原液、开链三萜类化合物、吐温80、乳化剂、cpg佐剂和铝佐剂。4、本发明开发了一种新型联合佐剂流感疫苗，其中的开链三萜类化合物、吐温80、乳化剂、cpg佐剂和铝佐剂在提高流感疫苗的保护效果，诱导更高的免疫方面具有协同功效，有效降低了抗原使用量，能够显著提高流感疫苗对60岁以上老年人群的免疫效果。5、优选地，所述开链三萜类化合物、吐温80、乳化剂、cpg佐剂和铝佐剂的质量比为(11-44):(1-5):(1-5):(0.025-0.1):(0.25-1)。6、上述11-44中的具体点值可以选择11、12、13、14、16、18、20、30、35、40、41、42、43、44等。7、上述1-5中的具体点值可以选择1、1.5、2、2.5、3、3.5、4、4.5、5等。8、上述0.025-0.1中的具体点值可以选择0.025、0.026、0.027、0.028、0.03、0.04、0.05、0.06、0.07、0.08、0.09、0.1等。9、上述0.25-1中的具体点值可以选择0.25、0.26、0.27、0.28、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1等。10、优选地，所述开链三萜类化合物包括角鲨烯、醇a、金合欢烯热二聚体或乙醚4。11、优选地，所述开链三萜类化合物为角鲨烯、醇a和金合欢烯热二聚体的组合。12、优选地，所述角鲨烯、醇a和金合欢烯热二聚体的质量比为(5-20):(3-12):(3-12)。13、上述5-20中的具体点值可以选择5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、16、18、19、20等。14、上述3-12中的具体点值可以选择3、3.5、4、5、6、7、7.5、8、9、10、11、11.5、12等。15、优选地，所述乳化剂包括山梨坦三油酸酯和/或失水山梨糖醇脂肪酸酯。16、优选地，所述cpg佐剂包括cpg 1018和/或cpg 2006。17、优选地，所述铝佐剂包括氢氧化铝。18、优选地，所述含有甲型流感病毒血凝素的单价原液中甲型流感病毒血凝素的型别包括h1n1型甲型流感病毒血凝素、h3n2型甲型流感病毒血凝素、h3n8型甲型流感病毒血凝素、h5n1型甲型流感病毒血凝素或h7n9型甲型流感病毒血凝素中任意一种或至少两种的组合。19、优选地，所述h1n1型甲型流感病毒血凝素、h3n2型甲型流感病毒血凝素、h3n8型甲型流感病毒血凝素、h5n1型甲型流感病毒血凝素和h7n9型甲型流感病毒血凝素的浓度各自独立地为10-70μg/ml。20、上述10-70μg/ml中的具体点值可以选择10μg/ml、11μg/ml、12μg/ml、15μg/ml、20μg/ml、30μg/ml、40μg/ml、50μg/ml、60μg/ml、68μg/ml、69μg/ml、70μg/ml等。21、优选地，所述含有乙型流感病毒血凝素的单价原液中乙型流感病毒血凝素的型别包括bv型乙型流感病毒血凝素和/或by型乙型流感病毒血凝素。22、优选地，所述bv型乙型流感病毒血凝素和by型乙型流感病毒血凝素的浓度各自独立地为10-70μg/ml。23、上述10-70μg/ml中的具体点值可以选择10μg/ml、11μg/ml、12μg/ml、15μg/ml、20μg/ml、30μg/ml、40μg/ml、50μg/ml、60μg/ml、68μg/ml、69μg/ml、70μg/ml等。24、第二方面，本发明提供了一种制备第一方面所述的新型联合佐剂流感疫苗的方法，所述方法包括以下步骤：25、(1)病毒株接种鸡胚，经培养、收获病毒液、纯化、裂解、病毒灭活、超滤后制成含有甲型流感病毒血凝素的单价原液；26、(2)病毒株接种鸡胚，经培养、收获病毒液、纯化、裂解、病毒灭活、超滤后制成含有乙型流感病毒血凝素的单价原液；27、(3)将步骤(1)和步骤(2)制备得到的单价原液进行混合，混合均匀后加入开链三萜类化合物、吐温80、乳化剂、cpg佐剂和铝佐剂，得到混合液；28、(4)将步骤(3)得到的混合液混合均匀后调整ph至6.5-8.0，再与pbs溶液混合搅拌0.5-2h。29、上述6.5-8.0中的具体点值可以选择6.5、6.6、6.7、6.8、7.0、7.2、7.4、7.6、7.8、7.9、8.0等。30、上述0.5-2h中的具体点值可以选择0.5h、0.6h、0.7h、0.8h、1.0h、1.2h、1.4h、1.6h、1.8h、1.9h、2.0h等。31、第三方面，本发明提供了第一方面所述的新型联合佐剂流感疫苗在预防流感中的应用。32、与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：33、(1)本发明开发了一种新型联合佐剂流感疫苗，解决了单一成分佐剂针对60岁以上老年人免疫效果不及预期的问题，新型联合佐剂流感疫苗其中的开链三萜类化合物、吐温80、乳化剂、cpg佐剂和铝佐剂在降低抗原使用量，显著提高流感疫苗的保护效果，诱导更高的免疫反应方面具有协同功效；34、(2)本发明中开链三萜类化合物为角鲨烯、醇a和金合欢烯热二聚体的组合时，新型联合佐剂流感疫苗具有更好的免疫作用；35、(3)本发明抗原可以是甲型单价、季节性三价和/或四价，可以灵活应对甲型流感变异引发的单价大流行，以及常规季节性流感流行或四价流感流行；36、(4)本发明相比国外针对老年人设计的高剂量60μg/ml疫苗，有效降低抗原使用量，能够有效应对疫苗短缺等问题。