一种地榆提取物及其制备方法和应用与流程

本发明属于制药，具体涉及一种地榆提取物及其制备方法和应用。背景技术：1、白细胞减少症是肿瘤放化疗中常见的副作用，约90％的肿瘤患者在接受化疗之后均会出现，造成机体免疫力低下，甚至诱发感染。白细胞是骨髓中的造血干细胞经过定向祖细胞、前体细胞而后形成的。白细胞的增殖和分化受到集落刺激因子和抑制性因子(粒细胞抑素，转化生长因子和乳铁蛋白等)的调节，可以抑制白细胞的增殖，限制白细胞的释放来减少外周血白细胞数量。白细胞减少症是指外周血液中的白细胞数目持续低于4×109/l，是肿瘤放化疗过程中常见的一种并发症。2、化疗药物通过抑制dna的增殖，从而杀死肿瘤细胞，然而由于其选择性较差，对正常的骨髓造血干细胞也会出现抑制增殖，导致白细胞数量减少。患者放化疗之后，白细胞减少症的发生率可达30％-50％，其临床主要表现为头晕乏力，四肢酸软，畏寒腰酸，如不及时治疗可继发严重感染。因此增强机体免疫力，特别增强机体抵抗白细胞减少症的能力，减少感染的发生率，成为提高抗癌治疗的关键性因素。临床上常用的治疗白细胞减少症的药物包括利血生，鲨肝醇，维生素b4以及集落刺激因子类，如惠尔血(重组人粒细胞集落刺激因子)，升白能(重组人粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子)等，这类药物虽然疗效显著，但存在作用时间短、价格昂贵等缺点，因此在临床应用上也受到一定限制。3、地榆具有凉血止血、解毒等功效，并能够恢复外周血象，增加白细胞数量，调节及改善机体免疫力中主要成分为地榆皂苷。临床研究或治疗中发现地榆皂苷中的地榆皂苷i、地榆皂苷ii是削弱化疗引发的白细胞减少的主要活性成分。现有技术中已经尝试使用地榆皂苷i或地榆皂苷ii制备注射剂，但是由于地榆皂苷i、地榆皂苷ii在水中的溶解度低，其生物利用度和注射剂的制剂性能不能令人满意。目前同行通过将地榆皂苷i或地榆皂苷ii与大量的表面活性剂或助溶剂配制以提高有效成分在制剂中的含量，上述制剂配制复杂，并且大量辅料的加入对制剂的保存条件要求大大提高。例如地榆皂苷i或地榆皂苷ii的脂质体制剂，贮存和制备过程中温度变化的对脂质体的稳定性影响较大，温度过高或过低都容易导致脂质体聚集融合，导致复溶的注射液不够稳定。虽然可以通过加入冷冻保护剂以减少冻干和解冻过程中对脂质体的破坏，然而这又进一步增加了注射液体系中的辅料含量。因此仍然需要寻找一种简便、高效的提升地榆皂苷制备注射剂的性能的方法。4、通过成盐提高药物水溶性，是开发药物静脉注射剂的主要方法。皂苷类成盐反应一般可以通过碱水解中和法，使其水解生成盐，但这种方法需要大量的碱，反应时间较长，操作复杂，并且副反应较多，生成产物较为复杂。皂苷类成盐反应还可以通过醇钠法，使用醇钠作为催化剂，这种反应虽然较快，但是转化效率较低。并且，实践中同一种皂苷与不同的碱生成盐之后，不同盐与未发生反应的皂苷相比，溶解度的提升幅度往往差异很大，对药效学、药物稳定性等的影响也很有可能会发生改变。地榆皂苷i或地榆皂苷ii均为母核为19α-羟基乌苏酸的皂苷，虽然上述成分可以采用碱水解中和法或醇钠法制备所述皂苷的钠盐来提高其溶解度和生物利用度，然而在实际研究中上述两种方法所制备得到的产物的反应完成度和溶解度并不能令人满意，虽然反应产物比地榆总皂苷或地榆皂苷i或地榆皂苷ii单体在水溶液中溶解度有所提高，但在ph＝7水溶液中所述当溶液中反应产物含量高于0.5mg/ml时仍然呈现浑浊的状态，并且上述产物在25℃下的溶解度高于37℃下的溶解度，可见其在进入体内之后其溶解度还要继续降低。上述产物在与不同的溶媒配伍时，随着时间的延长，不溶性微粒的分布也会发生变化。因此，现有技术仍然未能提供一种制备简单、成分稳定、治疗白细胞减少症效果好的地榆提取物注射剂及其制备方法。技术实现思路1、本发明的目的是提供一种地榆提取物注射剂及其制备方法和应用，本发明制备方法制得的地榆提取物注射剂生物利用度高，成分稳定、治疗白细胞减少症效果好，注射剂的微粒指标符合药典对注射剂的要求。2、为了实现上述目的，本发明提供了以下技术方案：3、本发明提供了一种地榆提取物注射剂的制备方法，所述制备方法包括以下步骤：4、步骤1：将地榆粉碎后提取、纯化并干燥，制备得到地榆总皂苷提取物，提取物中皂苷类成分的含量大于80％，黄酮类成分的含量低于1％，鞣质类成分的含量低于1％；5、步骤2：将步骤1的地榆总皂苷提取物加入粉末30-50倍量3-5wt％氢氧化钠溶液，得到混合液，将混合液放置于75-85℃水浴中，搅拌下保温反应5-7小时，将体系温度降至室温终止反应，减压浓缩至混合液1/3体积，得到浓缩液，减压抽滤，得到沉淀；6、步骤3：将步骤2的沉淀用10-30倍量的无水乙醇溶解，30～40℃下边搅拌边逐渐加入沉淀0.1-0.2倍量的葡甲胺固体，搅拌反应至葡甲胺不再继续溶解，并继续搅拌2～3小时，过滤除去多余的葡甲胺，滤液于30～40℃下减压回收蒸去大部分溶剂，冷却后冷藏过夜使其充分析出，过滤，减压抽滤后，将析出物在真空干燥箱中干燥，制得白色结晶状或无定型粉末状固体；7、步骤4：称取步骤3制备得的固体用注射剂溶媒搅拌均匀后配制成0.3-0.6mg/ml的溶液，调节溶液ph6.5-7.5，经微孔滤膜过滤，灭菌，分装即得。8、进一步地，所述步骤1中，地榆总皂苷提取物中的皂苷类成分的含量以地榆皂苷i计。9、进一步地，所述步骤1中，黄酮类成分的含量以芦丁计，鞣质含量以没食子酸计。10、进一步地，所述步骤1中地榆总皂苷提取物的提取方法包括下述步骤：11、s1：将地榆粉碎，加入地榆质量6-8倍量的60-70％(v/v)乙醇水溶液，回流提取2-3次，每次90-120min，合并提取液，静置冷却；12、s2：s1所得的提取液冷却后中加入乙醇，使乙醇调至86-90％(v/v)，加碱调ph值至13-14，静置15-17h，抽滤得到上清液；13、s3：s2所得的上清液通过减压浓缩至其中的乙醇至20-30％(v/v)，加水调乙醇至20％(v/v)，加碱调ph值至13-14，静置15-17h，离心，收集沉淀，得到地榆总皂苷粗品；14、s4：所得的总皂苷粗品用20-40倍量的无水乙醇加热回流10-30min，趁热过滤，待滤液冷至室温，搅拌下滴加水，至出现浑浊，且不消失，停止，静置10-12h，抽滤，用20-30％(v/v)乙醇洗涤沉淀，收集，真空干燥，粉碎，得纯化后的地榆总皂苷。15、优选地，所述步骤1中地榆总皂苷提取物的提取方法包括下述步骤：16、s1：将地榆粉碎，加入地榆质量7倍量的70％(v/v)乙醇水溶液，回流提取2次，每次90min，合并提取液，静置冷却；17、s2：s1所得的提取液冷却后中加入乙醇，使乙醇调至90％(v/v)，加碱调ph值至14，静置16h，抽滤得到上清液；18、s3：s2所得的上清液通过减压浓缩至中乙醇体积分至30％(v/v)，加水调乙醇体积分数至20％(v/v)，加碱调ph值至14，静置16h，离心，收集沉淀，得到地榆总皂苷粗品；19、s4：s3所得的总皂苷粗品用30倍量的无水乙醇加热回流20min，趁热过滤，待滤液冷至室温，搅拌下滴加水，至出现浑浊，且不消失，停止，静置12h，抽滤，用30％(v/v)乙醇洗涤沉淀，收集，真空干燥，粉碎，得纯化后的地榆总皂苷。20、步骤s4可根据需要再反复纯化一至两次。21、步骤s2中加碱为用10％氢氧化钠溶液调节ph值。22、步骤s4可经高效液相色谱检测提取物中地榆皂苷i、芦丁、没食子酸的含量。23、优选的，步骤1的纯化后的地榆总皂苷中皂苷类成分含量大于80％，黄酮含量低于1％，鞣质含量低于1％；24、优选的，步骤1中的地榆总皂苷也可以使用市售或其他常规方法制备地榆提取物替代，所述地榆提取物中皂苷类成分含量大于80％、黄酮类成分含量低于1％、鞣质类成分含量低于1％的。25、优选的，步骤1中的地榆总皂苷为地榆皂苷i含量大于80％的提取物，或地榆皂苷i单体。26、进一步地，所述步骤2中，将步骤1的地榆总皂苷提取物加入粉末40倍量4wt％氢氧化钠溶液，得到混合液，将混合液放置于80℃水浴中，搅拌下保温反应6小时，将体系温度降至室温，80℃减压浓缩至混合液1/3体积，得到浓缩液，减压抽滤，得到沉淀；27、进一步地，所述步骤3中，将步骤2的沉淀用20倍量的无水乙醇溶解，35℃下边搅拌边逐渐加入沉淀0.15倍量的葡甲胺固体，搅拌反应至葡甲胺不再继续溶解，并继续搅拌2小时，过滤除去多余的葡甲胺，滤液于35℃下减压回收蒸去大部分溶剂，冷却后冷藏过夜使其充分析出，过滤，减压抽滤后，将析出物在真空干燥箱中干燥，制得白色结晶状或无定型粉末状固体；28、进一步地，所述步骤4中，称取步骤3制备得的固体用注射剂溶媒搅拌均匀后配制成0.3mg/ml、0.5mg/ml或0.6mg/ml的溶液，调节溶液ph6.5、7.0或7.5，经0.22μm微孔滤膜过滤，灭菌，分装即得。29、本发明还提供了一种通过上述制备方法制备的地榆提取物注射剂。30、优选的，所述注射剂的溶媒选自纯化水、注射用水、灭菌注射用水、10％葡萄糖注射液、5％葡萄糖注射液、葡萄糖氯化钠注射液、0.9％氯化钠注射液中的一种或多种。31、优选的，所述注射剂的溶媒选自注射用水、10％葡萄糖注射液、5％葡萄糖注射液。32、本发明还提供了上述地榆提取物注射剂在制备预防和/或治疗化疗相关白细胞减少症的药物中的应用。33、优选的，前述应用中所述地榆注射剂能显著降低血清中il-6细胞因子水平。34、优选的，前述应用中所述地榆注射剂能显著降低血清中g-csf细胞因子水平。35、与现有技术相比，本发明的优点和有益效果为：36、1、本发明制备方法制得的地榆提取物注射剂中有效成分含量高，溶解度好，制剂稳定，微粒指标符合药典对注射剂的要求。37、2、本发明制备方法的反应条件温和、成本低、反应周期短、药效好、杂质少，适合工业化生产，具有规模化生产的可能性。38、3、本发明的地榆提取物注射剂生物利用度高，安全无毒，药效显著，远远优于同样给药量的地榆皂苷i、地榆皂苷ii、以及采用其他常规工艺制备的地榆提取物注射剂，接近阳性药rhg-csf的升白细胞水平，其可通过抑制il-6和g-csf细胞因子异常升高，使ctx造模显著降低小鼠外周血中白细胞水平恢复到正常水平，从而对白细胞减少症起到改善作用。