一种副结核病亚单位疫苗及其制备方法和应用

本发明涉及一种副结核病亚单位疫苗及其制备方法和应用，本发明属于医药。背景技术：1、副结核病（paratuberculosis），又称约内氏病（johne’s disease，jd），是由副结核分枝杆菌（ mycobacterium avium subsp. paratuberculosis，map）引起、导致牛羊等反刍动物产生肉芽肿性肠炎的慢性消耗性传染病，以肉芽肿性肠炎为典型病症，jd临床表现为顽固性腹泻、产奶量下降、严重消瘦、贫血和嗜睡，最终因恶化而死亡。jd不仅给畜牧养殖业造成巨大的经济损失，而且还威胁公共卫生安全。 2、由于jd存在潜伏期长、亚临床症状不明显、治疗效果不佳、检测方法不完善等问题，因此为降低感染风险，目前仍以扑杀患病动物作为主要的防控策略。但迄今为止，对阳性动物的检测和扑杀尚未达到预期的效果，因此有必要重新关注jd疫苗，免疫预防仍是预防世界范围内jd难题的有效途径。理想的疫苗接种不仅能有效减少扑杀带来的经济损失及患病动物map粪便脱落，而且还能有效降低临床感染病例等。目前，jd疫苗主要分为三大类：即全细胞灭活疫苗、减毒活疫苗和亚单位疫苗。3、目前，常用的商用map全细胞灭活疫苗包括mycopar、gudair和silirum。mycopar由灭活的禽分枝杆菌禽亚种18号菌株（p18）和矿物油佐剂联合组成，接种后可减少临床发病和map脱落，适用于map感染率高的畜群或实施副结核病控制措施有限的畜群，但该疫苗来源于禽分枝杆菌禽亚种（maa）的p18菌株，并不能提供完全类似于map的免疫原性，且对减少感染组织中的map数量没有效果，而且全细胞灭活疫苗还会干扰牛结核病的检疫和jd的诊断。减毒活疫苗是由map减毒菌株和油佐剂制成的活疫苗，用于牛、羊jd的免疫预防。map减毒菌株常应用转座子突变、等位基因交换和噬菌体介导等技术，通过敲除map的1个或多个毒力基因，经证明map的降低毒力、免疫原性良好而获得。研究表明，减毒活疫苗可诱导高水平的ifn-γ产生，并在减少炎症和清除抗酸菌等方面具有显著的保护作用。应用多种抗原库的减毒活疫苗能够通过刺激先天免疫和适应性免疫，引发针对抗map感染的免疫保护作用。接种map转座子突变株后，小鼠脾脏细菌负荷显著减少。在小型反刍动物感染模型中，使用等位基因交换技术获得的两种lav候选缺失株mapδrela和mapδleud对免疫山羊和小牛的攻毒具有保护作用，并能减少粪便中map的脱落，但在免疫绵羊中的感染实验中仍有80%的动物出现病变，牛接种map减毒活疫苗后会干扰牛结核病的检疫，且存在毒力返强的风险，特别是在免疫功能低下的个体和犊牛中。亚单位疫苗是由组分明确的重组map蛋白或编码免疫原性抗原的dna制备，与减毒活疫苗相比既无毒力返强的风险，又可减少接种部位炎症和肉芽肿的形成，且不会干扰牛结核病和jd检疫。然而，迄今为止测试的亚单位疫苗在小鼠感染模型中均不能提供完全的保护作用。亚单位疫苗在体内的半衰期短，因此通常需要多次免疫并使用佐剂才能起到保护效果。4、map3527是一种胰蛋白酶样丝氨酸蛋白酶，c端含有pdz结构域。map3527与rv0125具有同源区域，氨基酸同源区域高达75.4%，且rv0125能够诱导cd4+和cd8+t细胞产生ifn-γ，表明rv0125是一个很好的蛋白抗原。p22是一种具有免疫原性的map脂蛋白，属于分枝杆菌脂蛋白lppx/lprafg家族。p22也是map血清学检测的候选蛋白，在自然感染的牛中可以检测到抗p22蛋白抗体。ag85b（map1609c）属于ag85蛋白家族成员中的一个，该成员是分枝杆菌中分泌量最多的一组具有肌醇转移酶活性的蛋白。据研究报道，在小鼠模型中使用map3527和ag85b构建的重组蛋白66nc，与montanide isa 61 vg佐剂联合免疫后可诱导小鼠产生强烈的免疫反应，并对map的攻击提供很好的保护作用。5、综上，由于缺少有效的治疗方法且目前应用的副结核疫苗存在一定的缺陷，而淘汰患病动物造成饲养成本增加，因此开发免疫效果良好的新型副结核疫苗已成为免疫预防的迫切需要。技术实现思路1、本发明的目的在于提供一种副结核病亚单位疫苗及其制备方法和应用。2、为了达到上述目的，本发明采用了以下技术手段：3、本发明利用map的 map3527、map1609c（ag85b）和 p22基因，构建了2种重组质粒pet-28a-3527n-1609c-p22-3527c和pet-28a-3527n-p22-1609c-3527c，转入大肠杆菌bl21进行培养和表达，经ni柱亲和层析纯化后成功获得2种重组蛋白，根据其大小和排列方式分别命名为89ap和89pa。应用纯化的2种重组蛋白89ap和89pa，选取montanide isa 61 vg佐剂与蛋白乳化，经皮下多点注射，每三周免疫小鼠两次，以ifn-γ elispot实验进行筛选，与已报道含ag85b的融合蛋白66nc、含p22的融合蛋白58f以及ag85b+p22混合蛋白进行比较，并以pbs作为阴性对照。结果显示，重组抗原89ap能够诱导小鼠产生高水平的ifn-γ，显著高于对照蛋白（66nc、58f、66nc+58f及ag85b+p22混合蛋白），表明89ap的免疫效果优于对照蛋白。 4、此外，为了验证89ap蛋白免疫豚鼠后对接种牛结核菌素和副结核菌素的皮内变态反应情况，本发明应用牛结核菌素和副结核菌素对89ap蛋白等免疫后的豚鼠进行皮内变态反应检测，比较89ap免疫组与66nc免疫组、bcg免疫组、k-10免疫组和pbs对照组的变态反应差异。结果表明，在bcg免疫、k-10免疫阳性对照结果和pbs阴性对照结果均成立的情况下，不论是接种牛结核菌素还是副结核菌素，89ap免疫组和66nc免疫组接种部位均无迟发型变态反应出现（48h），并且89ap免疫组对89ap蛋白刺激和66nc免疫组对66nc蛋白刺激均出现强烈的变态反应，表明89ap蛋白免疫豚鼠后不会干扰结核病和副结核病的检疫，因此89ap是理想的候选重组亚单位疫苗，可作为预防jd的候选亚单位疫苗。5、在上述研究的基础上，本发明提出了一种副结核病亚单位疫苗，所述的疫苗中含有89ap重组抗原，所述的89ap重组抗原是将副结核分枝杆菌的 map3527、map1609c和 p22基因融合表达后得到的，所述的89ap重组抗原的氨基酸序列如seq id no.1。 6、其中，优选的，所述的89ap重组抗原是通过原核表达系统获得的。7、其中，优选的，所述的89ap重组抗原是通过将重组质粒pet-28a-3527n-1609c-p22-3527c，转入大肠杆菌bl21进行培养和表达，经ni柱亲和层析纯化后获得的，所述的重组质粒pet-28a-3527n-1609c-p22-3527c通过以下方法构建得到：8、（1） p22基因的pcr扩增： 9、以提取的map k-10株全基因组dna为模板，用引物p22-f/r扩增 p22基因；获得的pcr产物鉴定正确后使用胶回收试剂盒回收并测定浓度，于-20 ℃冰箱冷冻保存； 10、；11、（2）pet-28a-3527n-1609c-3527c载体的单酶切：12、使用hind iii单酶切pet-28a-3527n-1609c-3527c载体，酶切后产物鉴定正确后用胶回收试剂盒回收并测定浓度，于-20 ℃冰箱冷冻保存；13、（3）酶切载体与pcr产物的连接：14、将pet-28a-3527n-1609c-3527c酶切产物分别与 p22产物进行连接，构建重组质粒pet-28a-3527n-1609c-p22-3527c； 15、（4）转化连接产物：16、在e.coil dh5α感受态细胞中分别加入连接后产物，混匀后冰浴30 min，立刻于42℃水浴锅热激30-45 s，立即再冰浴2 min；加入500 μl lb液体培养基，37 ℃ 180 rpm复苏60 min，3 500 rpm离心5 min，弃上清，沉淀菌体用100 μl lb液体培养基重悬，涂布在含50μg/ml卡那霉素的lb固体平板培养基上，37 ℃温箱培养24 h，获得单菌落；挑取单个生长状态良好的单菌落接种于5 ml含50 μg/ml卡那霉素的lb液体培养基中，37 ℃ 180 rpm过夜培养，菌液3 500 rpm离心5 min，使用质粒小提试剂盒提取质粒，pcr以及测序鉴定重组质粒pet-28a-3527n-1609c-p22-3527c；17、（5）89ap蛋白的诱导表达：18、（5.1）过表达蛋白bl21 菌株的构建：19、将5-10 μl鉴定正确的重组质粒pet-28a-3527n-1609c-p22-3527c转入50 μle.coil bl21感受态细胞中；20、（5.2）重组蛋白的诱导表达：21、于lb固体培养基中挑取bl21单菌落，接种于5 ml含50 μg/ml卡那霉素的lb液体培养基中，37 ℃ 180 rpm培养24 h。取100 μl菌液转接于10 ml含50 μg/ml卡那霉素的lb液体培养基中继续培养至od600≈0.8，收集1 ml诱导前全菌液制样保存后，余下菌液加入终浓度1 mm 的iptg，37 ℃ 180 rpm诱导蛋白表达4 h，收集1 ml诱导后全菌液制样保存；22、（5.3）重组蛋白的鉴定：23、用western blot 分析重组蛋白的诱导表达情况，将重组蛋白命名为89ap；24、（6）89ap蛋白的纯化。25、其中，优选的，所述的步骤（6）包括以下步骤：26、（6.1）从lb固体平板培养基上挑取鉴定过的bl21单菌落，接种于10 ml含50 μg/ml卡那霉素的lb液体培养基中，37 ℃ 180 rpm培养24 h；取10 ml菌液转接于1 l含50 μg/ml卡那霉素的lb液体培养基中继续培养至od600≈0.8，加入终浓度1 mm的iptg，37 ℃ 180rpm诱导蛋白表达4 h，4 ℃ 8 000 rpm离心10 min收集菌体沉淀，每1 l菌体沉淀使用40ml buffer a重悬后冰浴超声破碎，超声程序为：振幅38%，超声3 s，停止3 s，有效超声时间30 min。超声破碎后4℃ 3 500 rpm初步离心10 min，离心后弃沉淀碎片，取上清再次10000 rpm离心30 min；27、其中，所述的buffer a为含有150 mm nacl，10%v/v甘油的20 mm tris-hcl，ph8.0；28、（6.2）蛋白为包涵体表达，收集离心后的沉淀，用80 ml buffer b重悬沉淀，使用转子室温搅拌过夜至溶液清亮，4 ℃ 10 000 rpm离心30 min，收集上清，用buffer b将浓度稀释到1 mg/ml以下，转移至透析袋中，每100 ml透析袋中的上清使用1 l复性液浸泡，在4 ℃搅拌18 h后，将透析袋更换至buffer a中，在4 ℃搅拌18 h。复性结束后取出透析袋中上清，4℃ 12 000 rpm离心30min，收集上清；29、其中，所述的buffer b为含有150 mm nacl，0.8% w/v skl，10%v/v甘油的20 mmtris-hcl，ph 8.0；30、所述的复性液为含有0.54 g还原型谷胱甘肽，0.06 g氧化型谷胱甘肽，150 mmnacl，3%v/v甘油的150 mm tris-hcl，ph 7.5；31、（6.3）取20 μl挂柱前上清留样，做穿前液；32、（6.4）用20 ml buffer a流穿ni-nat层析柱平衡柱料后，将上清蛋白穿过层析柱，接取流穿液，反复挂柱重复6次。33、（6.5）取20 μl挂柱后上清留样，做穿过液；34、（6.6）用20 ml buffer a流穿ni-nat层析柱平衡柱料，再加5 ml buffer a重悬柱料，取20 μl柱料混悬液留样，做穿过树脂；35、（6.7）分别用40 ml buffer c，40 ml buffer d，40 ml buffer e，40 ml bufferf，20 ml buffer g，20 ml buffer h流穿柱子，洗掉杂蛋白；36、其中，所述的buffer c为含有500 mm nacl，3%v/v甘油，20 mm咪唑的20 mm tris-hcl，ph 8.0；所述的buffer d为含有500 mm nacl，3%v/v甘油，40 mm咪唑的20 mm tris-hcl，ph 8.0；所述的buffer e为含有500 mm nacl，3%v/v甘油，60 mm咪唑的20 mm tris-hcl，ph 8.0；所述的buffer f为含有500 mm nacl，3%v/v甘油，80 mm咪唑的20 mm tris-hcl，ph 8.0；所述的buffer g为含有500 mm nacl，3%v/v甘油的20 mm tris-hcl，ph 8.0；所述的buffer h为含有1 m nacl，3%v/v甘油，80 mm咪唑的20 mm tris-hcl，ph 8.0；37、（6.8）用20 ml buffer a流穿ni-nat层析柱平衡柱料，再加5 ml buffer a重悬柱料，取20 μll柱料混悬液留样，做洗杂后树脂；38、（6.9）待柱料自然沉淀后，避免把柱料悬起，缓慢加入5 ml的buffer i，于冰上静置20 min后收集自然留下的洗脱液1，再加入5 ml的buffer j，冰上静置20 min后收集洗脱液2，最后加入5 ml的buffer k，冰上静置20 min后收集洗脱液3，3种洗脱液分别取20 μl做样；39、其中，所述的buffer i为含有150 mm nacl，5%v/v甘油，500 mm咪唑的20 mmtris-hcl，ph 8.0；所述的buffer j为含有150 mm nacl，5%v/v甘油，1 m咪唑的20 mmtris-hcl，ph 8.0；所述的buffer k为含有150mm nacl，5%v/v甘油，2 m咪唑的20 mm tris-hcl，ph 8.0；40、（6.10）用20 ml buffer a流穿ni-nat层析柱平衡柱料，再加5 ml buffer a重悬柱料，取20 μl柱料混悬液留样，做洗脱后树脂；41、（6.11）sds-page凝胶电泳鉴定收集的蛋白样品；42、（6.12）根据sds-page凝胶电泳分析结果，收集蛋白洗脱液，使用30 kda超滤浓缩离心管4 ℃ 3 500 rpm超滤除盐后，浓缩体积至1 ml以下，用0.45 μm滤器过滤除菌，测定蛋白浓度后，-80℃备用保存。43、其中，优选的，所述的疫苗中还包含佐剂。44、其中，优选的，所述的佐剂为montanide isa 61 vg 佐剂。45、其中，优选的，所述的疫苗是将89ap重组抗原与montanide isa 61 vg 佐剂以1：1.2重量比例乳化后得到的。46、进一步的，本发明还提出了所述的副结核病亚单位疫苗在制备预防副结核病药物中的应用。47、相较于现有技术，本发明的有益效果是：48、目前，重组蛋白亚单位疫苗的开发与应用是预防传染病的重要手段，重组蛋白表达系统和先进的纯化技术为新型疫苗开发提供了新的解决方案。重组蛋白可以通过使用基因融合技术改善目的蛋白的免疫原性、蛋白半衰期、蛋白溶解度等。重组蛋白表达系统包括细菌、酵母、杆状病毒、哺乳动物细胞和无细胞系统等，通过质粒、细菌或病毒载体表达的抗原，可以诱导强烈的细胞免疫反应。其中，因大肠杆菌具有易操作、低成本、表达快、产量高等优点，是目前重组蛋白表达的首选宿主。本发明依据map的 map3527、p22和 map1609c基因，通过大肠杆菌表达构建的重组质粒，获得了2种以包涵体为表达方式的重组蛋白89ap和89pa，通过超声波裂解、蛋白变性及复性的处理，获得正确折叠的重组表达蛋白，通过ni柱亲和层析纯化后超滤除盐和浓缩后，获得2种高纯度的重组蛋白。 49、本发明以 p22、map1609c和 map3527c蛋白编码基因为基础，表达和纯化2种重组蛋白89ap和89pa，以期筛选出免疫原性和保护效果好的map亚单位疫苗候选重组抗原。制备的重组蛋白89ap、89pa、66nc、ag85b+p22和66nc+58f，通过与montanide isa 61 vg 佐剂乳化后免疫小鼠，以ifn-γ elispot方法，筛选到的map亚单位疫苗候选重组抗原89ap表现突出，不仅能诱导小鼠产生强烈的细胞免疫和体液免疫反应，对map感染能够提供良好的保护作用，而且不会干扰结核和副结核的检疫，表明89ap是副结核病理想的亚单位候选疫苗，为副结核病新型疫苗研发奠定了重要的科学基础。