TSG6修饰脂肪干细胞外泌体在制备治疗宫腔粘连药

本发明属于生物医药领域，具体涉及一种tsg6修饰脂肪干细胞外泌体在制备治疗宫腔粘连药物中的应用。背景技术：1、宫腔粘连(iua)又称asherman综合征，是由于子宫内膜损伤导致宫腔部分或全部闭塞，从而导致月经异常、不孕与反复流产，其发生与创伤、妊娠、感染等因素有关。中重度宫腔粘连的患者子宫内膜基底层破坏较严重，子宫内膜及腺体的再生能力低下且子宫内膜的容受性差，临床预后差。2、目前临床常用的治疗方法是经宫颈粘连切除术(tcra)。为了提高iua的疗效，可以先插入宫内节育器和宫内球囊。宫内节育器和球囊可以扩张狭窄的宫腔，改善患者的远期预后。然而，iua的预后仍不理想。科学研究证实，间充质干细胞能有效修复宫腔粘连患者的子宫内膜，并提高生育力。目前,主要用于宫腔粘连研究的有子宫内膜间充质干细胞、骨髓间充质干细胞、脂肪间充质干细胞(adipose tissue-derived stromal cells，adscs)及妊娠附属物来源的间充质干细胞。它们主要通过免疫调控、分化、损伤趋化及旁分泌作用,来重建子宫内膜组织，改善子宫内膜功能,是宫腔粘连患者的新希望，近年来，越来越多的研究表明脂肪间充质干细胞来源的外泌体与adscs具有相似的生物学功能，但它们更稳定，免疫原性及致瘤致畸性低，因此有望成为无细胞治疗的新策略。adsc-exo是adscs天然释放的纳米囊泡，直径为40～160nm，其内包含有大量的蛋白质、氨基酸、代谢产物和核酸等，即mrna、非编码rna和dna等活性物质，其可作为细胞间的通讯工具，参与免疫调节、血管增生等复杂的病理生理过程。3、其中脂肪间充质干细胞来源的外泌体(exosome)可有效治疗iua，但其机制尚不明确。因此明确脂肪间充质干细胞来源外泌体治疗宫腔粘连的机制且发明一种可以有效治疗宫腔粘连的外泌体对治疗宫腔粘连具有很重要的意义。技术实现思路1、针对上述提出的问题，本发明提供tsg6修饰脂肪干细胞外泌体在制备治疗宫腔粘连药物中的应用，揭示脂肪间充质干细胞来源的外泌体有效治疗宫腔粘连的机制是肿瘤坏死因子刺激基因-6(tsg6)起作用，且采用tsg6修饰脂肪干细胞外泌体治疗宫腔粘连，可提高治疗效果；将tsg6修饰的脂肪干细胞外泌体与温敏性水凝胶复合，可使外泌体在组织中更容易富集，保存时间更长，生物学功能更稳定，治疗效果更好。2、本发明提供以下技术方案：3、一种tsg6修饰脂肪干细胞外泌体在制备治疗宫腔粘连的药物中的应用，该tsg6修饰是指tsg6在脂肪干细胞外泌体中过表达。4、进一步地，上述tsg6修饰脂肪干细胞外泌体由以下方法制得：5、(1)培养脂肪干细胞，使用胰酶消化后进行细胞铺板；6、(2)使用无血清培养基稀释tsg6构建的质粒dna，质粒dna的浓度为0.016～0.02μg/μl；7、(3)使用无血清培养基稀释lipofectamine rnaimax试剂，lipofectaminernaimax试剂的体积分数为2％～6％，稀释后的lipofectamine rnaimax同步骤(2)所得稀释的tsg6 dna混合并室温保温20～25min得到混合复合物；8、(4)对步骤(1)所得脂肪干细胞进行转染，将步骤(3)所得混合复合物加入到步骤(1)所得培养板中，混匀并在co2的体积分数为4～6％，温度为36～38℃环境下保温24～48h，分离纯化得到过表达tsg6的脂肪干细胞外泌体。9、进一步地，上述制备过程中的细胞铺板在含血清不含抗生素的培养基中进行。10、进一步地，上述转染时细胞的密度为70～75％。11、一种tsg6修饰脂肪干细胞外泌体复合凝胶，包括上述tsg6修饰脂肪干细胞外泌体。12、上述tsg6修饰脂肪干细胞外泌体复合凝胶的制备方法，包括以下步骤：13、(1)将壳聚糖加入醋酸溶液中搅拌得到壳聚糖混合溶液；14、(2)将β-甘油磷酸钠水溶液与步骤(1)所得壳聚糖混合溶液混合搅拌过滤后，得到温敏性水凝胶(cs/gp)；15、(3)室温下将所述tsg6修饰脂肪干细胞外泌体与温敏性水凝胶(cs/gp)混合均匀，得到tsg6修饰脂肪干细胞外泌体复合凝胶。16、进一步地，上述步骤(1)中壳聚糖混合溶液中，醋酸的浓度为0.18～0.22m，优选为0.1m，壳聚糖的质量体积分数为1.8～2.2％，优选为2％，壳聚糖的脱乙酰度为90％～95％，优选为91％。17、采用上述进一步技术方案的有益效果为：18、壳聚糖的脱乙酰度会影响凝胶的凝胶温度，脱乙酰度降低，会使温敏性水凝胶的凝胶温度升高，选择脱乙酰度为91％的壳聚糖制备温敏性水凝胶，有利于其在生物体中发挥作用。19、进一步地，上述β-甘油磷酸钠水溶液中β-甘油磷酸钠的质量体积分数为50％～60％，优选为50％，β-甘油磷酸钠水溶液与壳聚糖混合溶液按体积比为1:5混合，过滤时通过孔径为0.20～0.24μm的滤膜进行过滤，优选为0.22μm。20、进一步地，上述tsg6修饰脂肪干细胞外泌体复合凝胶中tsg6修饰的脂肪干细胞外泌体的浓度为0.8～1.2μg/μl，优选为1μg/μl。21、上述tsg6修饰脂肪干细胞外泌体复合凝胶在制备治疗宫腔粘连的药物中的应用。22、采用上述技术方案，本发明的有益效果为：23、本发明揭示了脂肪间充质干细胞来源的外泌体有效治疗宫腔粘连的机制是tsg6起作用，tsg6是间充质干细胞(mscs)分泌的细胞因子之一，msc-exo中含有并且参与tsg6的递送，tsg6参与免疫调节，参与调控巨噬细胞极化，tsg6可诱导巨噬细胞向m2型巨噬细胞极化，促进抗炎细胞因子的表达，同时抑制m1型巨噬细胞极化及促炎因子表达；其次tsg6可调控巨噬细胞和子宫内膜基质成纤维细胞的交流，抑制子宫内膜基质成纤维细胞转变为肌成纤维细胞，本发明采用tsg6修饰adcs-exo，治疗iua效果提高。24、本发明采用tsg6修饰的adcs-exo与温敏性水凝胶复合制备外泌体复合凝胶(tsg6-exo@cs)，该凝胶进入生物体内，温度升高，则由溶胶转变为凝胶的状态，温敏性水凝胶由于能够识别外部环境的温度变化并对它们产生响应，从而控制tsg6修饰的adcs-exo在宫腔内以一定的时间和速率释放，从而到达更好的治疗，并且负载exo的水凝胶可以使得exo在组织中更容易富集，保存时间更长，生物学功能更稳定，为治疗iua提供新思路。技术特征：1.一种tsg6修饰脂肪干细胞外泌体在制备治疗宫腔粘连的药物中的应用，该tsg6修饰是指tsg6在脂肪干细胞外泌体中过表达。2.根据权利要求1所述的tsg6修饰脂肪干细胞外泌体在制备治疗宫腔粘连的药物中的应用，其特征在于，所述tsg6修饰脂肪干细胞外泌体通过以下方法制得：3.根据权利要求2所述的tsg6修饰脂肪干细胞外泌体在制备治疗宫腔粘连的药物中的应用，其特征在于，所述细胞铺板在含血清不含抗生素的培养基中进行。4.根据权利要求2所述的tsg6修饰脂肪干细胞外泌体在制备治疗宫腔粘连的药物中的应用，其特征在于，所述转染时细胞的密度为70～75％。5.一种tsg6修饰脂肪干细胞外泌体复合凝胶，其特征在于，包括权利要求1～4任一项所述的tsg6修饰脂肪干细胞外泌体。6.权利要求5所述的tsg6修饰脂肪干细胞外泌体复合凝胶的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：7.根据权利要求6所述的tsg6修饰脂肪干细胞外泌体复合凝胶的制备方法，其特征在于，所述步骤(1)中壳聚糖混合溶液中，醋酸的浓度为0.18～0.22m，壳聚糖的质量体积分数为1.8～2.2％，壳聚糖的脱乙酰度为90％～95％。8.根据权利要求6所述的tsg6修饰脂肪干细胞外泌体复合凝胶的制备方法，其特征在于，所述β-甘油磷酸钠水溶液中β-甘油磷酸钠的质量体积分数为50％～60％，β-甘油磷酸钠水溶液与壳聚糖混合溶液的体积比为1:5，过滤时通过孔径为0.20～0.24μm的滤膜进行过滤。9.根据权利要求6所述的tsg6修饰脂肪干细胞外泌体复合凝胶的制备方法，其特征在于，所述tsg6脂肪干细胞外泌体复合凝胶中tsg6脂肪干细胞外泌体的浓度为0.8～1.2μg/μl。10.权利要求5所述的tsg6修饰脂肪干细胞外泌体复合凝胶在制备治疗宫腔粘连的药物中的应用。技术总结本发明公开了一种TSG6修饰脂肪干细胞外泌体在制备治疗宫腔粘连药物中的应用，属于生物医药领域，揭示了脂肪干细胞来源的外泌体有效治疗宫腔粘连的机制是肿瘤坏死因子刺激基因‑6起作用。本发明采用肿瘤坏死因子刺激基因‑6修饰脂肪干细胞的外泌体治疗宫腔粘连，可提高治疗效果；将肿瘤坏死因子刺激基因‑6修饰的脂肪干细胞外泌体与可注射性温敏水凝胶复合，可使外泌体在组织中更容易富集，保存时间更长，生物学功能更稳定，治疗效果更好。技术研发人员：王晓红,孙惠君,陈丽华,董杰,陈书强,雷晖,鲁雪燕,芦洁,熊俞婧,苏丹杰,方正,茅佳钦受保护的技术使用者：中国人民解放军空军军医大学技术研发日：技术公布日：2024/8/16