一种脱细胞骨基质的骨修复支架的制备方法及应

本发明属于生物，涉及一种脱细胞骨基质的骨修复支架的制备方法及应用。背景技术：1、由于骨组织再生能力有限，超过临界尺寸的骨缺损一直是神经外科和骨科医生面临的临床挑战，如严重创伤、肿瘤切除、癌症、先天性疾病或牙槽骨缺损引起的大面积骨缺损。鉴于自体骨移植存在不可避免的缺点(例如供体部位疼痛、手术时间增加、伤口感染风险和可用性不足)，许多合成生物材料被专门设计为骨修复和再生的替代品。2、纳米级羟基磷灰石(ha)是一种人工合成材料，模拟了天然骨的无机组分，具有优良的生物相容性和生物安全性，可与骨紧密结合并易于塑形。ha在生理环境中表现稳定，其颗粒在血液进入骨骼后溶解释放钙和磷，促进新骨形成，并增加碱性磷酸酶活性，从而快速诱导新骨生成(zhang et al.,front bioeng biotechnol.2022.10:911180.；hou et al.,j funct biomater.2022.13(4):187.)。ha和β-tcp(β-磷酸三钙)在骨组织工程中被称为“双相磷酸钙”陶瓷(bcp)，需要经过高温烧结将两者融合成陶瓷。然而，尽管双相磷酸钙陶瓷bcp支持细胞的粘附，但其生物相容性较差，且机械强度过高、脆性大、应力创面愈合差(li et al.,regen biomater.2023.10:rbad013.)。技术实现思路1、本发明的目的在于提供一种复合型g-bcp的骨修复支架，以实现能够通过骨修复支架进行良好的力学支撑(压缩强度>20mpa)，同时满足骨修复支架具有良好的生物相容性、骨诱导性、降解速率，移植到体内后可以快速矿化、诱导新生骨的目的。2、为了解决现有技术中存在的技术问题，本发明提供了以下的技术方案：3、本发明提供了一种骨修复支架，所述骨修复支架包括gelma、ha、β-tcp，按照质量浓度百分比包括：4、gelma 5％-12％，5、ha 5％-15％，6、β-tcp 5％-15％；7、所述骨修复支架的孔隙率为40％-70％，所述骨修复支架的机械强度为20～40mpa。8、进一步，所述骨修复支架中gelma质量浓度百分比为10％；9、进一步，所述骨修复支架中所述gelma的取代度包括75％-90％。10、进一步，所述gelma的取代度为75％、90％。11、进一步，所述ha为纳米级ha。12、进一步，所述β-tcp为微米级β-tcp。13、进一步，所述骨修复支架还包括光引发剂lap。14、进一步，所述骨修复支架需要进行光固化处理，所述光固化处理的时间大于或等于5min。15、进一步，所述骨修复支架还包括decm涂层。16、进一步，所述骨修复支架还包括bmp2。17、进一步，所述骨修复支架还包括细胞因子或药用小分子。18、进一步，所述药物小分子包括细胞毒剂、抗癌剂、抗瘤剂、化疗剂、抗肿瘤剂、抗病毒剂、抗菌剂、抗炎剂、免疫调节剂、免疫应答检查点试剂、生物反应调节剂、细胞因子、趋化因子、维生素、类固醇、配体、镇痛剂、放射性药物、放射性同位素或用于视觉检测的染料。19、本发明保护的g-bcp支架的组分范围按照质量浓度百分比包括：gelma 5％-12％，ha 5％-15％，β-tcp 5％-15％。20、在一些实施方案中，使用纳米级ha和微米级β-tcp颗粒掺入到gelma中，改良骨修复支架的机械性能、生物相容性和骨传导性。在一些实施方案中，所述骨修复支架的孔隙率包括40％、41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、48％、49％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％。在一些实施方案中，所述骨修复支架的机械强度包括20mpa、21mpa、22mpa、23mpa、24mpa、25mpa、26mpa、27mpa、28mpa、29mpa、30mpa、31mpa、32mpa、33mpa、34mpa、35mpa、36mpa、37mpa、38mpa、39mpa、40mpa。21、在一些实施方案中，所述含decm涂层的骨修复支架还能负载药用小分子，所述药用小分子包括但不限于细胞毒剂、抗癌剂、抗瘤剂、化疗剂、抗肿瘤剂、抗病毒剂、抗菌剂、抗炎剂、免疫调节剂(例如免疫增强剂或抑制子)、免疫应答检查点试剂、生物反应调节剂、细胞因子、趋化因子、维生素、类固醇、配体、镇痛剂、放射性药物、放射性同位素或用于视觉检测的染料。22、药用小分子可以是任何本文所述的那些，或者可以是其药学上可接受的盐。如本文所用，术语“药学上可接受的盐”是指本文所述的活性剂和/或免疫调节剂的任何盐形式，其对于向目标受试者施用是安全和有效的，并且具有所期望的生物学、药物和/或治疗活性。药学上可接受的盐包括酸性或碱性基团的盐。药学上可接受的酸加成盐可包括但不限于盐酸盐、氢溴酸盐、氢碘酸盐、硝酸盐、硫酸盐、硫酸氢盐、磷酸盐、酸式磷酸盐、异烟酸盐、醋酸盐、乳酸盐、水杨酸盐、柠檬酸盐、酒石酸盐、泛酸盐、酒石酸氢盐、抗坏血酸盐、琥珀酸盐、马来酸盐、龙胆酸盐、富马酸盐、葡萄糖酸盐、葡萄糖醛酸盐、糖酸盐、甲酸盐、苯甲酸盐、谷氨酸盐、甲磺酸盐、乙磺酸盐、苯磺酸盐、对甲苯磺酸盐和双羟萘酸盐(即，1,1'-亚甲基-双-(2-羟基-3-萘甲酸盐))。合适的碱盐可以包括但不限于铝、钙、锂、镁、钾、钠、锌和二乙醇胺盐。23、本发明提供了一种骨修复支架的制备方法，所述制备方法包括：24、ha和β-tcp溶解于dpbs中；避光条件下将gelma加入到混合溶液中溶解，溶解后加入lap，取混合液于模具中，光固化处理后制备得到骨修复支架。25、进一步，所述制备方法中gelma、ha、β-tcp的质量浓度分别为5％-12％、5％-15％、5％-15％。26、进一步，所述gelma质量浓度百分比为10％。27、进一步，所述gelma的取代度包括75％-90％。28、进一步，所述gelma的取代度为75％、90％。29、进一步，所述光固化处理大于等于5min。30、进一步，所述光固化处理使用的光为405nm紫外光。31、在一些具体的实施方案中，所述骨修复支架的制备方法包括步骤：ha和β-tcp溶解于dpbs中，震荡，破碎，之后将混合溶液放入37℃水浴中继续溶解；避光条件下将gelma加入到混合溶液中，震荡后置于37℃水浴中避光溶解，每隔30min震荡一次；充分溶解后加入bmp2和lap震荡，置于37℃水浴中保温；取混合液于模具中，第一次-20℃冷冻，用405nm紫外光固化，第二次-20℃冷冻过夜，冻干，制备得到骨修复支架。32、在一些实施方案中，所述bmp2的浓度为20μg/ml，lap的浓度为5％。在一些具体的实施方案中，gelma的取代度包括75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％。在一些实施方案中，所述第一次-20℃冷冻时间包括24h及以上，以所需目标支架的孔隙率和力学性能为准。33、在一些实施方案中，所述gelma、ha、β-tcp的质量浓度分别为5％-12％、5％-15％、5％-15％，三者的质量浓度在各自范围内自由组合，gelma、ha、β-tcp的质量浓度单位为w/v。在一些具体的实施方案中，所述gelma的质量浓度为5％、5.5％、6％、6.5％、7％、7.5％、8％、8.5％、9％、9.5％、10％、10.5％、11％、11.5％、12％。在一些具体的实施方案中，所述ha的质量浓度为5％、5.5％、6％、6.5％、7％、7.5％、8％、8.5％、9％、9.5％、10％、10.5％、11％、11.5％、12％、12.5％、13％、13.5％、14％、14.5％、15％。在一些具体的实施方案中，所述β-tcp的质量浓度为5％、5.5％、6％、6.5％、7％、7.5％、8％、8.5％、9％、9.5％、10％、10.5％、11％、11.5％、12％、12.5％、13％、13.5％、14％、14.5％、15％。34、进一步，所述制备方法还包括制备gelma的步骤，具体如下：35、明胶倒入dpbs中，搅拌溶解，加入氯仿，4℃倒置过夜，去除残余氯仿，37℃水浴溶化，完全溶化后50℃搅拌，缓慢滴加ma，避光反应；将溶液离心后保留上清，调节ph值为中性，转移至透析袋，封装，置于40℃纯净水中搅拌透析72h，每2-4h换纯净水一次；透析完成后，溶液与-20℃或-80℃冷冻过夜，之后冻干3-4天，得到干燥的gelma冻干品。36、进一步，所述明胶终浓度为10％w/v。37、进一步，所述ma的滴加流速保持在1s/滴。38、进一步，ma与明胶的比例为1.25-1.5mlma：1g明胶。39、在一些实施方案中，所述ma与明胶的比例为1.25ml：1g，1.3ml：1g，1.35ml：1g，1.4ml：1g，1.45ml：1g，1.5ml：1g。在一些实施方案中，缓慢滴加ma避光反应结束以前的搅拌速度不超过900rpm。40、进一步，所述制备方法还包括如下步骤：41、将骨修复支架灭菌后接种成骨细胞，使用om培养基培养，一段时间后换成om+ra分化培养基，在接种成骨细胞3-14天，取骨修复支架进行脱细胞处理，处理后获得含decm涂层的骨修复支架。42、进一步，所述om培养基包括dmem高糖培养基、1％its-g、10％fbs、1mmβ-甘油2-磷酸二钠水合物、50μg/ml l-抗坏血酸2-磷酸、20ng/mlfgf-2、100nm地塞米松、1％丙酮酸钠、1％glutamax、1％neaa、1％penicilin-streptomycin。43、进一步，所述om+ra分化培养基包括高糖dmem、1％its-g、10％fbs、1mmβ-甘油2-磷酸二钠水合物、50μg/ml l-抗坏血酸2-磷酸、20ng/mlfgf-2、100nm地塞米松、1％丙酮酸钠、1％glutamax、1％neaa、1％penicilin-streptomycin、1μm视黄酸。44、进一步，所述脱细胞处理使用物理方法进行脱细胞处理。45、进一步，所述物理方法为冻融。46、在一些实施方案中，所述成骨细胞采用在先专利申请cn2023114742491(一种诱导多能干细胞分化为成骨细胞和骨细胞的方法)中的方法制备而成，在此全文引入。47、在一些实施方案中，所述脱细胞物理法通过超声、高压、冻融等物理手段破坏细胞膜，从而实现脱细胞效果；化学法利用去污剂改变细胞膜的通透性，使细胞溶胀破裂，完成脱细胞过程；生物酶法则主要使用核酸酶、胰蛋白酶等对组织及器官进行脱细胞处理。48、本发明提供了一种3d打印墨水，所述3d打印墨水包括gelma、ha、β-tcp，按照质量浓度百分比包括：49、gelma 5％-12％，50、ha 5％-15％，51、β-tcp 5％-15％，52、所述3d打印墨水未经过光固化处理。53、进一步，所述gelma质量浓度百分比为10％。54、进一步，所述gelma的取代度包括75％-90％。55、进一步，所述gelma的取代度为75％、90％。56、进一步，所述ha为纳米级ha。57、进一步，所述β-tcp为微米级β-tcp。58、进一步，所述3d打印墨水还包括光引发剂lap。59、进一步，所述骨修复支架还包括bmp2。60、进一步，所述3d打印墨水低温避光保存。61、进一步，所述3d打印墨水低温4℃避光保存。62、进一步，所述骨修复支架还包括细胞因子或药用小分子。63、进一步，所述药物小分子包括细胞毒剂、抗癌剂、抗瘤剂、化疗剂、抗肿瘤剂、抗病毒剂、抗菌剂、抗炎剂、免疫调节剂、免疫应答检查点试剂、生物反应调节剂、细胞因子、趋化因子、维生素、类固醇、配体、镇痛剂、放射性药物、放射性同位素或用于视觉检测的染料。64、本发明提供了一种3d打印墨水的制备方法，所述制备方法包括：65、ha和β-tcp溶解于dpbs中；避光条件下将gelma加入到混合溶液中溶解，溶解后加入lap，取混合液于容器中，不进行光固化处理得到3d打印墨水。66、进一步，所述制备方法中gelma、ha、β-tcp的质量浓度分别为5％-12％、5％-15％、5％-15％。67、进一步，所述gelma质量浓度百分比为10％。68、进一步，所述gelma的取代度包括75％-90％。69、进一步，所述gelma的取代度为75％、90％。70、进一步，所述3d打印墨水低温避光保存。71、进一步，所述3d打印墨水低温4℃避光保存。72、进一步，所述制备方法还包括制备gelma的步骤，具体如下：73、明胶倒入dpbs中，搅拌溶解，加入氯仿，4℃倒置过夜，去除残余氯仿，37℃水浴溶化，完全溶化后50℃搅拌，缓慢滴加ma，避光反应；将溶液离心后保留上清，调节ph值为中性，转移至透析袋，封装，置于40℃纯净水中搅拌透析72h，每2-4h换纯净水一次；透析完成后，溶液与-20℃或-80℃冷冻过夜，之后冻干3-4天，得到干燥的gelma冻干品。74、进一步，所述明胶终浓度为10％w/v。75、进一步，所述ma的滴加流速保持在1s/滴。76、进一步，ma与明胶的比例为1.25-1.5mlma：1g明胶。77、本发明提供了前面所述的骨修复支架、前面所述的骨修复支架的制备方法、前面所述的3d打印墨水、或前面所述的3d打印墨水的制备方法在制备骨修复材料中的应用。78、进一步，所述骨修复材料包括骨缺损的修复材料。79、进一步，所述骨缺损包括颅骨、桡骨、牙槽骨、尺骨、腓骨、锁骨、肱骨、骨盆、股骨、髌骨、胫骨、距骨、跟骨、舟骨、楔状骨、跖骨、掌骨、趾骨、肩胛骨、脚踝、下颌骨或椎骨的缺损。80、在一些实施方案中，所述骨缺损包括骨折。在一些实施方案中，所述骨缺损为颅骨缺损。81、在本发明中，所使用的术语“骨缺损”指的是骨组织中的任何缺失区域，包括但不限于空隙、间隙、隐窝或其他形式的不连续性。该骨缺损可能是由人为因素引起的，也可能是自然发生的，例如由于疾病或外伤。骨缺损可能是病理性疾病或炎症性疾病、骨肿瘤的形成或切除、外科手术干预、先天性缺陷或骨折等因素的结果。在某些情况下，例如骨肿瘤，骨缺损可能是由于肿瘤组织的切除而人为造成的。本发明的骨修复支架可应用于多种情况，包括但不限于牙周缺损的修复、颅面或颌面的外科手术或重建、手部手术、关节重建、骨折修复、整形外科手术以及脊柱手术(例如脊柱融合术和椎体成形术)。此外，术语“骨缺损”还包括在没有疾病或肿瘤的情况下，患者希望增强骨特征的解剖位置，例如在选择性整容外科手术中。因此，“缺损”可以是患者主观认为的，且增强骨缺损区域是所期望的。82、本发明中使用的术语“骨修复材料”、“骨填充材料”、“填充材料”或“修复材料”可以互换使用，指的是用于填充或修复骨缺损的任何材料，包括可原位硬化的材料，例如可流动介质。骨修复材料还可以包括其他类型的“填充物”，如丝状物、微球、粉末、粒状元件、片状物、条状物、管状物等，以及自体移植材料或异体移植材料。填充材料还可能包括其他化学品、药理学制剂或其他生物活性剂。所述“可流动介质”通常指的是可吸收或不可吸收的生物相容性制剂，例如聚合物，包括热固性聚合物或热塑性聚合物，如pmma(聚甲基丙烯酸甲酯)、骨空隙填充材料、水泥或药物制剂。83、本发明提供了一种骨修复材料，所述骨修复材料包括前面所述的骨修复支架以及支撑骨架，所述支撑骨架包括多层框架及层间连接体；84、进一步，所述支撑骨架由pla、plga、pcl中的一种或几种制成。85、进一步，所述支撑骨架上具有涂层，所述涂层包括活性因子或药用小分子。86、进一步，所述涂层包括镁离子或淫羊藿苷。87、本发明提供了前面所述的骨修复支架、前面所述的骨修复支架的制备方法、前面所述的3d打印墨水、或前面所述的3d打印墨水的制备方法在制备促进血管新生，加速骨矿化，加速骨修复，促进细胞黏附、生长、增殖、矿化，药物缓释载体的产品中的应用。88、本发明的优点和有益效果：89、本发明涉及复合型g-bcp骨修复支架的制备，并进一步涉及一种脱细胞基质decm涂层的复合型g-bcp骨修复支架的制备。通过混合gelma、ha、β-tcp三种材料，并添加骨诱导因子bmp2，经光固化成模(或3d打印)制备骨支架g-bcp，进一步负载hipscs衍生的成骨细胞后经物理方法脱细胞，获得decm涂层的g-bcp支架。该支架可以提供良好的力学支撑(压缩强度>20mpa)，具有良好的生物相容性、骨诱导性、降解速率，移植到体内后可以快速矿化、诱导新生骨。工艺制备流程简单、易操作，无需压模或高温烧结等特殊条件，可实现稳定的大规模生产以满足未来临床需求。本发明旨在提供一种创新的、个性化的治疗方案，以改善大面积骨缺损的修复速度和效果。此技术结合了细胞生物学、材料科学、再生医学和3d打印技术，以满足患者的个性化需求。