一种玉米中多类农兽药共残留非靶向筛查方法与

本发明涉及农兽药共残留检测，特别是一种玉米中多类农兽药共残留非靶向筛查方法。背景技术：1、传统的食品中污染物筛查方法大多是建立一套包含多种农兽药的数据库。这些方法能够有效识别数据库内的污染物，但却无法识别数据库外的污染物，给食品安全蒙上了一层阴影。例如，近年来发生的一些影响恶劣的食品安全事件，都是因为一些企业或个人非法添加不属于食品常规检测范围内的污染物(即预料外污染物)，即使污染物的浓度远远超过食品安全红线，这些不合格的产品还是被鉴定为合格，最终发展成为极其严重的食品安全事件。由此可见，不断建立新的污染物数据库进行植物源食品中预料外农兽药筛查是一种被动方式，会消耗大量人力物力，也无法满足日益增长的对食品中预料外农兽药检测的需求。因此，开发高效的非靶向污染物筛查方法已成为一种流行趋势，正如欧盟委员会norman网络所提倡的。2、利用代谢组学在处理样本量小、干扰物多、噪声高等复杂特征的海量数据方面表现出的极大优势，将其应用于食品中预料外污染物筛查领域表现出巨大的前景。在代谢组学分析过程中，通过自建数据库或网络数据库(如massbank、scifinder、chemspider、pubchem和metlin)筛查和鉴定食品基质中代表预料外污染物的标志化合物，从而达到非靶向筛查污染物的目的。3、众所周知，代谢组学数据是由较少的样本和大量的特征(即变量)组成。如何提取出有价值的信息，找到符合条件的，能够代表标志化合物的特征变量，是研究人员需要解决的首要问题。一般来说，任何两组(如实验组与对照组)代谢组学数据之间可区分因素是一个多变量的组合，而不是单个变量。因此，主成分分析(pca)、正交偏最小二乘判别分析(opls-da)、随机森林(rf)和支持向量机(svm)等化学计量学方法被广泛用于处理这些代谢组学数据。在这些建模方法中，svm由于其预测性能良好，因而在代谢组学研究中得到广泛应用。pca和opls-da只能应用于线性假设，而svm在核函数辅助下可以应用于非线性情况，而且svm具有良好的泛化能力。支持向量机递归式特征消除(svmrfe)是一种采用权重规则对变量进行排序的包装法特征选择算法，在样本数量少而变量数量多的情况下效果良好。由于svmrfe所具有的这个特点与代谢组学数据特征相似，因此svmrfe被经常用于代谢组学研究。此外，有报道指出，svmrfe具有比opls-da更好的预测能力。迄今为止，涉及svmrfe的代谢组学研究主要应用于疾病诊断中的生物标志物筛查，但对食品基质中污染物的非靶向筛查研究尚未见报道。技术实现思路1、为了解决上述技术问题，本发明提供了一种玉米中多类农兽药共残留非靶向筛查方法。2、为达到上述目的，本发明是按照以下技术方案实施的：3、一种玉米中多类农兽药共残留非靶向筛查方法，包括以下步骤：4、s1、分别配制多种农药、兽药的浓度为100μg/ml的甲醇溶液，各取1ml进行混合，再用甲醇稀释成1μg/ml的混合溶液，得到农兽药的混合溶液；将恩诺沙星-d5和莠去津-d5的甲醇溶液用甲醇稀释成100ng/ml混合溶液，得到恩诺沙星-d5和莠去津-d5的混合溶液；5、s2、使用研磨机将玉米样品磨成玉米粉末，按照1g：10μl的比例取玉米粉末和农兽药的混合溶液，加入到多个50ml聚丙烯离心管中，并在每个聚丙烯离心管中加入0.5ml浓度为100ng/ml的恩诺沙星-d5和莠去津-d5的混合溶液作为回收率内标；然后制备理论浓度分别为20、50和100ng/ml的农兽药的混合溶液；每个浓度的农兽药的混合溶液重复制备9次得到9个平行样品；6、s3、将20ml乙腈/水溶液倒入每个聚丙烯离心管，涡旋1min后超声提取30min；每个聚丙烯离心管再加入6.0g的无水na2so4和1.5g的naac，剧烈震荡1min，6000r/min离心5min；将所有上清液移入装有2.0g无水na2so4和0.3g psa的新离心管中，6000r/min离心2min；7、s4、提取全部溶液，氮吹至近干，用1ml甲醇和甲酸铵水溶液组成的混合缓冲溶液复溶复溶，涡旋1min；经0.22μm滤膜过滤，制备理论浓度分别为20、50和100ng/ml的多种农兽药混合样品溶液。每个浓度实验重复9次得到9个平行样品；8、s5、将三个浓度组的27个样品，分别命名为20ng/ml-1～20ng/ml-9、50ng/ml-1～50ng/ml-9和100ng/ml-1～100ng/ml-9；从上述27个溶液中各取30μl混合制成质控qc样品，该样品在各浓度组样品进样前和进样后分别进样3次，共计12次，命名为qc-1、qc-2、…、qc-12，用于lc-ms/ms仪器稳定性评价；9、s6、采用四极杆/静电场轨道阱lc-ms/ms系统对所有农药、兽药和内标进行分析，将lc-ms/ms系统输出的文件格式由.raw转换为.mzxml，然后上传到workflow4metabolomics平台进行分析，通过峰检测、峰对齐和保留时间校准处理所有色谱峰，然后对峰强度进行归一化、中心化、尺度化和数据转换，形成以变量名和样品名分别为横、纵坐标的数据矩阵，并作为数据集；10、s7、采用径向基函数rbf为核函数的支持向量机，将数据集随机分成10个子集，进行10倍交叉验证，计算10次准确率的平均值；该过程重复10次，得到平均准确率作为最终的支持向量机模型分类准确率。通过将训练数据集随机分为三个子集的3倍交叉验证方法选择核参数，选择交叉验证精度最高的参数作为核参数进行实际分类，得到训练好的支持向量机模型。11、进一步地，所述乙腈/水溶液由体积比为80：20的乙腈和水混合后，加入体积比为1％的醋酸配制而成。12、进一步地，所述甲醇和甲酸铵水溶液组成的混合缓冲溶液复溶由体积比为40：60的甲醇和甲酸铵水溶液混合而成。13、进一步地，lc-ms/ms系统对所有农药、兽药和内标进行分析的过程为：14、采用esi正离子模式获取m+h型加合物进行代谢组学分析：进样量10μl，采用accucore rp-ms色谱柱分离溶液组分；流动相为洗脱液a和洗脱液b，流速0.3ml/min；洗脱程序为：100％a，0min；100％a，2min；0％a，8min；0％a，13min；100％a，14min；直至洗脱结束；柱温保持在40℃；q exactive plus参数设置包括：(a)加热和毛细管温度为320℃；(b)鞘气和辅助气为n2，流量分别为40和10arb；(c)透镜电压和喷雾电压分别为50和3200v；(d)扫描模式为全扫描/数据依赖二级扫描；(e)一级质谱参数为全扫描分辨率70000，自动增益控制目标1×106，最大驻留时间100ms，m/z扫描范围100～1000；(f)二级质谱参数为分辨率17500，自动增益控制目标2×105，最大驻留时间50ms。15、进一步地，所述洗脱液a由体积分数为0.1％的甲酸和浓度为4mmol/l的甲酸铵水溶液组成；所述洗脱液b由体积分数为0.1％的甲酸和浓度为4mmol/l的甲酸铵甲醇溶液组成。16、与现有技术相比，本发明首次将支持向量机辅助代谢组学方法应用于植物源食品中农兽药的非靶向筛查，可以有效识别124个农兽药中的120个，而单独使用代谢组学方法只能识别出109个，说明支持向量机可以提高代谢组学方法的筛查精度，该方法有望在更多的基质和污染物范围内为污染物非靶向筛查提供新的思路。