一种复合佐剂及含该复合佐剂的卵黄抗体的制备

本发明涉及抗体技术，具体涉及一种复合佐剂及含该复合佐剂的卵黄抗体的制备方法。背景技术：1、猫传染性鼻气管炎是由猫疱疹病毒1型(feline herpesvirus type 1，fhv-1)引起的以急性上呼吸道症状为特征的高度接触性传染病，临床症状包括体温升高、咳嗽、打喷嚏、呼吸啰音、流泪、精神沉郁和眼鼻浆液性或脓液性分泌物增多等症状及死亡，但以上呼吸道症状为主，是目前已知最重要的猫呼吸道疾病之一。主要采用注射疫苗进行预防，尚无特异性疗法。2、现有技术中虽然有关于猫传染性鼻气管炎病毒卵黄抗体的报道，但是其免疫蛋鸡后蛋黄中的效价偏低，以及免疫次数过多的问题，如cn114634564a公开的猫疱疹病毒卵黄抗体的中和抗体效价不低于1:64，不能达到使用需求；又如cn115611979a公开的猫传染性鼻气管炎病毒卵黄抗体的中和抗体效不低于1:512，蛋鸡免疫次数为6～8次。3、通常情况下，灭活疫苗和亚单位疫苗均需要使用佐剂才能达到预定效果，因此疫苗佐剂在灭活疫苗和亚单位疫苗发挥作用过程中非常重要，不可缺少。经过接近100年的发展，目前形成了多种系列的佐剂，常用的佐剂包括矿物盐佐剂、弗氏佐剂、白油佐剂、免疫复合物佐剂、脂质体佐剂、蜂胶佐剂、核酸佐剂、细胞因子佐剂和微生物佐剂等多种类别免疫佐剂系统。市场上可供使用的佐剂超过100种，但从应用角度来看，很多佐剂均不理想，仍然需要一种能够以较高的配比跟抗原配合使用且具有良好的生物相容性和稳定性的动物疫苗佐剂。4、复合佐剂是指将具有两种或多种不同作用机制的佐剂，科学、有机的组合在一起，通过协同/叠加作用，增强/促进抗原特异性或全面的免疫应答，最大限度的发挥佐剂效应和降低副反应的发生程度，因而研发具有多种激活作用机制和功能的新型复合佐剂就成为当下高效疫苗创制研究领域最为紧迫的关键技术和科学问题。技术实现思路1、针对现有技术的不足，本发明的提供一种复合佐剂，由白油佐剂和cpg佐剂的复合佐剂按照比例混合，将该复合佐剂加入到卵黄疫苗的制作中，可具有缓释抗原，减少免疫次数。2、为达到此发明目的，本发明采用以下技术方案：3、第一个方面，本发明提供一种复合佐剂，所述复合佐剂由白油佐剂和cpg佐剂组成。4、进一步地，所述白油佐剂浓度为50％(体积百分含量v/v)，所述cpg佐剂的浓度为50～100μg/ml。5、第二个方面，本发明提供一种猫传染性鼻气管炎病毒抗原疫苗，所述抗原疫苗包括猫传染性鼻气管炎病毒抗原和如上所述的复合佐剂。6、进一步地，如上所述猫传染性鼻气管炎病毒为cp2株(fhv cp2株)，由本公司分离鉴定，于2022年07月保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为cgmcc no.45219。7、进一步地，所述猫传染性鼻气管炎病毒抗原与所述复合佐剂的体积比为1:1。8、第三个方面，本发明提供一种猫传染性鼻气管炎病毒卵黄抗体的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：9、s1将如权利要求3或4所述的抗原疫苗免疫蛋鸡；10、s2检测免疫后鸡蛋蛋黄中抗体中和效价；11、s3分离纯化蛋黄中卵黄抗体。12、进一步地，所述步骤s1免疫程序为：免疫剂量为1.0ml/只，腿部或胸部肌肉注射，免疫间隔为14日，共免疫3次。13、进一步地，所述s2具体为将蛋黄用乙酸-乙酸钠缓冲液进行倍稀释，离心取上清，检测卵黄粗提液中猫传染性鼻气管炎病毒中和抗体效价，当中和抗体效价≥1:128时，开始收集鸡蛋。14、进一步地，所述s3分离纯化为采用固体硫酸铵分步沉淀。15、进一步地，所述采用固体硫酸铵分步沉淀具体为在所述步骤s2获得的上清中加入终浓度33％～35％的固体硫酸铵进行沉淀纯化，静置，12000r/min～14000r/min离心10～15min，取沉淀，将沉淀溶解至原体积的1/4体积的生理盐水中，加入终浓度33％～35％的固体硫酸铵进行沉淀纯化，搅拌至硫酸铵完全溶解，静置，12000r/min～14000r/min离心10～15min，取沉淀，再取沉淀，将沉淀溶解至原体积的1/4体积的生理盐水中，加入终浓度33％～35％的固体硫酸铵进行沉淀纯化，搅拌至硫酸铵完全溶解，静置，12000r/min～14000r/min离心10～15min，取沉淀；16、超滤浓缩除硫酸铵，将第三次硫酸铵沉淀溶解于第三次沉淀原体积的生理盐水中，搅拌至沉淀完全溶解，超滤除盐，当浓缩液体积为原体积的1/10时，用生理盐水补充至原体积，反复至少5次，直至用2％bacl2溶液检测膜下液无白色沉淀产生；浓缩至中和抗体效价均不低于1:512；浓缩液经0.22μm过滤除菌后，得卵黄抗体。17、第四个方面，本发明提供了如上所述制备方法制备的卵黄抗体在猫传染性鼻气管炎紧急预防药物中的应用。18、本发明的有益效果在于：19、本发明提供的复合佐剂为白油佐剂和cpg佐剂，以白油佐剂isa78为载体系统，通过抗原的缓释作用，刺激机体产生体液和细胞免疫反应。以cpg1018佐剂为免疫刺激分子，诱导机体产生以th1型免疫反应为主的细胞免疫反应，将这两种功能的佐剂有机结合在一起，研发成一种安全、高效的复合佐剂。20、在疫苗中加入本发明的复合佐剂，经蛋鸡免疫，用更少的免疫次数可以收获较高抗体的高免鸡蛋。采用酸稀释法对蛋黄进行抗体粗提，然后采用硫酸铵沉淀法进行抗体纯化，最后超滤浓缩除盐后，制成效价可达1:512的卵黄抗体。本发明提供复合佐剂具有安全、高效的特点，制成的含有该复合佐剂的猫传染性鼻气管炎病毒卵黄抗体，效价高、稳定性好、见效快、不会产生耐药性，可应用于快速治疗或紧急预防猫传染性鼻气管炎病毒感染，保护率高。技术特征：1.一种复合佐剂，其特征在于，所述复合佐剂由白油佐剂和cpg佐剂组成。2.如权利要求1所述的复合佐剂，其特征在于，所述白油佐剂浓度为50％(v/v)，所述cpg佐剂的浓度为50～100μg/ml。3.一种猫传染性鼻气管炎病毒抗原疫苗，其特征在于，所述抗原疫苗包括猫传染性鼻气管炎病毒抗原和如权利要求1或2所述的复合佐剂。4.如权利要求3所述的抗原疫苗，其特征在于，所述猫传染性鼻气管炎病毒抗原与所述复合佐剂的体积比为1:1。5.一种猫传染性鼻气管炎病毒卵黄抗体的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述步骤s1免疫程序为：免疫剂量为1.0ml/只，腿部或胸部肌肉注射，免疫间隔为14日，共免疫3次。7.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述s2具体为将蛋黄用乙酸-乙酸钠缓冲液进行倍稀释，离心取上清，检测卵黄粗提液中猫传染性鼻气管炎病毒中和抗体效价，当中和抗体效价≥1:128时，开始收集鸡蛋。8.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述s3分离纯化为采用固体硫酸铵分步沉淀。9.如权利要求8所述的方法，其特征在于，所述采用固体硫酸铵分步沉淀具体为在所述步骤s2获得的上清中加入终浓度33％～35％的固体硫酸铵进行沉淀纯化，静置，12000r/min～14000r/min离心10～15min，取沉淀，将沉淀溶解至原体积的1/4体积的生理盐水中，加入终浓度33％～35％的固体硫酸铵进行沉淀纯化，搅拌至硫酸铵完全溶解，静置，12000r/min～14000r/min离心10～15min，取沉淀，再取沉淀，将沉淀溶解至原体积的1/4体积的生理盐水中，加入终浓度33％～35％的固体硫酸铵进行沉淀纯化，搅拌至硫酸铵完全溶解，静置，12000r/min～14000r/min离心10～15min，取沉淀；10.如权利要求5所述制备方法制备的卵黄抗体在猫传染性鼻气管炎紧急预防药物中的应用。技术总结本发明提供了一种复合佐剂，所述复合佐剂由白油佐剂和CPG佐剂组成。本发明通过白油佐剂和CpG佐剂的复合佐剂的加入，制成疫苗，提高蛋鸡蛋黄中的猫疱疹病毒中和抗体效价，减少蛋鸡免疫次数，节约成本，提高动物福利。另外，免疫后蛋黄中提取生产制备的猫传染性鼻气管炎病毒卵黄抗体不低于1:512，可用于猫传染性鼻气管炎病毒的紧急预防和治疗。技术研发人员：夏振强,姜旭,张馨月,倪婷婷,蒋凡,祖宁,吕忠蕾,栾福英,付玉,卢继龙,刘伟,石晶受保护的技术使用者：长春西诺生物科技有限公司技术研发日：技术公布日：2024/8/16