使用可注射、中性pH可溶性胶原-糖胺聚糖组合物

本发明描述了使用可注射、中性ph可溶性胶原和天然糖胺聚糖组合物充填软组织的方法。本发明受到天然细胞外基质中胶原和大分子糖胺聚糖(如透明质酸)组合物的启发。胶原提供了优异的细胞粘附和组织整合的生物相容性。而大分子糖胺聚糖(如透明质酸或肝素，特别是交联透明质酸或肝素)具有良好的保水性和机械性能，有助于软组织充填效果的持久性。这些组合物还可用于刺激组织再生。组合物经过化学处理，以在中性ph产生温度稳定的粘稠溶液。注射到组织中后，这些溶液迅速发生凝胶化和聚合，形成含有交联或未交联大分子糖胺聚糖的纤维胶原基质。背景技术：1、30多年来，胶原组合物已被用于软组织充填或平滑软组织缺陷，如皮肤皱纹和皮肤褶皱，增加凹槽体积或修正皮肤轮廓的不均匀性和松弛。2、用于软组织充填的胶原组合物由以下几种成分构成：从动物皮中提取的溶解胶原重组而成的胶原纤维，从可溶性重组人胶原重组而成的胶原纤维，或从人皮加工的完整胶原纤维或纤丝。在所有情况下，胶原组合物都由胶原纤维/纤丝或交联胶原纤维/纤丝构成。3、有许多文献描述了胶原在软组织充填中的应用或作为皮肤填充剂的使用。几篇重要的文献附在本技术中。此外，还有许多已颁布和待批的专利提及了用于软组织充填的胶原。这些专利的列表也附在本技术中。4、由于软组织主要由胶原基质构成，用胶原或胶原基组合物修正软组织缺陷是合理的。自1981年以来，美国市场上至少有12种fda批准的胶原产品可用于软组织充填。这些产品通常被称为皮肤填充剂。然而，目前大多数基于胶原的填充剂已不再在美国市场上销售。它们已被更耐用的组合物取代，包括透明质酸产品，以及含有羟基磷灰石微球、聚乳酸颗粒和聚甲基丙烯酸甲酯微球的产品。5、由于胶原可以作为支持细胞附着和细胞增殖的支架，并通过生物活性粘附位点在体内进行组织整合，改进的胶原基组合物在软组织充填中的应用仍然引起了关注。软组织充填的胶原基组合物的弱点在于，胶原基软组织填充剂通常在3至6个月内会逐渐降解并失去其充填效果。因此，这些组合物必须具有更高的耐用性。6、交联大分子糖胺聚糖如交联透明质酸因其持久性和优良的安全性而广泛用于软组织充填。然而，由于大分子糖胺聚糖缺乏细胞粘附性，它们通常对细胞或组织整合“惰性”。(图9)。将胶原与大分子糖胺聚糖结合是一种开发具有细胞生长促进特性和在组织空间内长时间持续的软组织支架的策略，以减少皮纹、折痕、细纹、皱纹或疤痕，或它们的组合。oded shoseyov博士及其同事发明了光引发皮肤填充剂，透明质酸-胶原双交联皮肤填充剂(转让给胶原有限公司(collagen ltd)的美国专利号17/052216)。向表皮浅层表面施加光以诱导包括该专利中描述的光引发剂的组合的聚合。7、胶原对温度和离子强度敏感，在适当的温度下和生理条件下会驱动自发的凝胶形成。本发明描述了使用胶原-糖胺聚糖组合物充填软组织的方法，该组合物呈粘稠的生物相容性凝胶形式，可以通过小针头(例如27号针)轻松注射，并且注射到组织中后迅速发生凝胶化和纤维形成。形成的胶原-糖胺聚糖基质具有独特的性质，使其耐用性超过当前的任何可注射胶原填充剂，并且促进因胶原组成组织的降解或损伤而发生的细胞生长、组织整合、愈合或替代超过了当前的任何可注射透明质酸产品，以及含有羟基磷灰石微球、聚乳酸颗粒和聚甲基丙烯酸甲酯微球的产品。技术实现思路1、本发明公开了一种可注射的软组织填充物，该填充物包含衍生化胶原或原位聚合胶原和糖胺聚糖，形成促进细胞生长的支架，以及在某些情况下使用软组织填充物用于软组织充填的方法。2、在本技术的一方面，提供了一种用于软组织充填的组合物，该组合物包含：(i)中性ph可溶性胶原；和(ii)糖胺聚糖；和(iii)任选地，其他活性成分，其中中性ph可溶性胶原与糖胺聚糖混合。3、在一些实施方式中，中性ph可溶性胶原选自下组：衍生化胶原或原位聚合胶原或其组合。在一些实施方式中，糖胺聚糖选自下组：交联和/或非交联糖胺聚糖。4、在一些实施方式中，所述其他活性成分选自下组：5、(a)血浆或富血小板血浆或包含至少一种生长因子的血浆或富血小板血浆，优选浓度为1重量％-50重量％；6、(b)无细胞脂肪提取物或包含至少一种生长因子的无细胞脂肪提取物，优选浓度为0.1重量％-5重量％；7、(c)无细胞干细胞提取物或包含至少一种生长因子的无细胞干细胞提取物，优选浓度为0.1重量％-5重量％；8、(d)由干细胞分泌的细胞外囊泡(ev)，优选浓度为0.1重量％-5重量％；9、(e)必需氨基酸或至少一种必需氨基酸，优选浓度为0.1重量％-5重量％；10、(f)从虹鳟鱼(oncorhynchus mykiss)或大马哈鱼(oncorhynchus keta)精子细胞中提取的多核苷酸(pn)和/或多脱氧核糖核苷酸(pdrn)，分子量范围为50至1500kda，优选浓度为0.1-2重量％；11、(g)局部麻醉药如利多卡因、普鲁卡因，优选浓度为0.1重量％至0.5重量％；12、(h)稳定剂或溶解促进剂，如甲基磺酰甲烷(msm)，优选浓度为0.1重量％至5重量％；和13、(i)其任何组合。14、在一些实施方式中，糖胺聚糖与中性ph可溶性胶原的比例为10:1至1:10。在一些实施方式中，糖胺聚糖的浓度为5至50mg/ml。15、在一些实施方式中，胶原的来源选自同种异体组织、哺乳动物组织(通常为猪、牛、马的皮肤或肌腱)或海洋物种或美西螈皮衍生基质。16、在一些实施方式中，胶原选自全胶原或去端肽胶原，或从微生物、植物、昆虫细胞或动物细胞中提取的重组胶原或重组胶原肽或胶原模拟肽。17、在一些实施方式中，衍生化胶原通过乙酰化试剂衍生化，这些试剂改变了胶原的pka，并具有以下一个或多个特征：(a)在中性ph(如6.5-7.5)可溶；(b)在生理ph不经历纤维形成；和/或(c)在酸性ph(如3.5-5.5，优选4.0-5.0)沉淀。18、在一些实施方式中，衍生化胶原通过选自下组的一种或多种试剂进行衍生化：戊二酸酐、丁二酸酐、顺丁烯二酸酐、柠檬酸酐、草酸酐和乙二胺四乙酸酐。19、在一些实施方式中，中性ph可溶性胶原形成如us10,111,981b2中描述的快速聚合胶原凝胶。20、在一些实施方式中，快速聚合胶原凝胶包含中和溶液，该溶液包含酸性可溶胶原、edta/egta和多元醇，其中酸性可溶胶原包含选自下组的胶原：i型胶原、ii型胶原、iii型胶原及其组合。21、在一些实施方式中，酸性可溶胶原的浓度在5至70mg/ml。在一些实施方式中，所述edta是edta二钠；和/或所述egta是egta二钠。在一些实施方式中，edta或egta的浓度在10至50mm。在一些实施方式中，所述多元醇是糖醇，如d-甘露醇。在一些实施方式中，多元醇的浓度在2.5％至4％(w/v)。在一些实施方式中，所述快速聚合胶原凝胶进一步包含二糖、果糖或其组合。在一些实施方式中，所述快速聚合胶原凝胶的渗透压为280-360mmol/kg。22、在一些实施方式中，糖胺聚糖选自：透明质酸、肝素前体、肝素、硫酸软骨素、硫酸皮肤素、硫酸角质素及其任意组合中的一种或多种。23、在一些实施方式中，糖胺聚糖源自同种异体组织、哺乳动物组织或海洋物种；和/或通过微生物发酵生产。24、在一些实施方式中，交联前的糖胺聚糖分子量为1000da-10000000da。25、在一些实施方式中，交联糖胺聚糖的交联剂独立选自：1,4-丁二醇二缩水甘油醚(bdde)、l-[3-(二甲氨基)丙基]-3-乙基碳二亚胺甲碘化物(edc)、聚乙二醇二缩水甘油醚(pegde)、n,n'-二环己基碳二亚胺(dcc)、n,n'-二异丙基碳二亚胺(dic)、二缩水甘油辛烷(deo)、二乙烯基砜(dvs)、戊二醛、或对苯二甲基碳二亚胺、或1,2,7,8-二缩水甘油辛烷、或聚乙二醇(peg)或富含氨基基团的低聚物(如聚赖氨酸或聚精氨酸或γ-聚谷氨酸)或其组合。26、在一些实施方式中，透明质酸选自：寡透明质酸、通过使用链球菌种或芽孢杆菌种进行微生物发酵生产的透明质酸，或从同种异体或动物组织(包括鸡冠、人脐带、牛滑液或玻璃体液)中提取的透明质酸。27、在本技术的一些方面，提供了一种制备包含(i)中性ph可溶性胶原；(ii)糖胺聚糖；和(iii)任选的其他活性成分的组合物的方法，所述方法包括选自以下的一个或多个步骤：28、(a)将部分(i)与部分(ii)组合，例如通过使用真空行星搅拌机将部分(ii)添加到部分(i)中，形成可注射的均匀凝胶，优选的旋转速度为200rpm-1,400rpm，自转速度为100rpm-700rpm，优选的混合时间为10-30分钟，在无菌条件下进行真空混合；或29、(b)将乙醇沉淀的部分(ii)添加到部分(i)的盐或ph沉淀物中，并添加部分(iii)(如果存在)，通过透析、透析过滤或超滤过程重新溶解组合，形成均匀的可注射凝胶；或30、(c)将部分(i)、部分(ii)和部分(iii)(如果存在)组合，例如将部分(i)、部分(ii)和部分(iii)进行无菌冷冻干燥，然后重新溶解冻干的部分(i)、部分(ii)和部分(iii)的混合物，并透析组合至中性ph，形成均匀的可注射凝胶。31、在本技术的一些方面，提供了一种在需要的对象的表皮下组织空间中充填软组织或诱导细胞生长促进支架的方法，所述方法包括将权利要求1的组合物施用于需要充填或诱导的部位。32、在一些实施方式中，所述组合物被注射到软组织中以修正软组织缺陷。在一些实施方式中，所述组合物被注射到真皮中以修正软组织缺陷，包括皱纹、真皮皱褶、真皮松弛、不均匀、面部消瘦、脂肪萎缩、面颊凹陷、眼窝凹陷或其组合。在一些实施方式中，所述组合物被注射到真皮以外的组织中，包括软骨，以修正组织缺陷。33、在一些实施方式中，所述组合物可通过25-30号针或套管注射，例如25、27或30号针或套管。