一种富含脂肪干细胞外泌体的组合物及其应用的

本发明属于生物，具体涉及一种富含脂肪干细胞外泌体的组合物及其应用。背景技术：1、创伤对人体有较为严重的影响，发生创伤后，机体会产生一系列复杂的生理反应，包括释放多种损伤因子，这些因子可能引发严重病症，如急性呼吸窘迫综合征；此外，创伤还会直接损害器官或系统的形态和功能，导致生理和代谢紊乱。在重度创伤情况下，机体可能释放大量有害介质，如炎性介质和细胞因子。这些介质通过级联放大效应可能导致过度炎症反应，进一步加重组织器官的损伤。2、脂肪干细胞作为一种具有多向分化潜能的成体干细胞，已被广泛应用于组织再生和修复的研究中。而外泌体，作为脂肪干细胞释放的一种纳米级囊泡，富含多种生长因子、信号分子和微小rna等生物活性成分，具有促进细胞增殖、分化、迁移以及调节免疫反应等多种生物学功能，同时抑制炎症反应和细胞凋亡，为创伤部位提供有利的修复环境。技术实现思路1、为解决以上技术问题，根据本发明的一个方面，提供一种富含脂肪干细胞外泌体的组合物。2、本发明解决上述技术问题所提供的技术方案如下：3、一种富含脂肪干细胞外泌体的组合物，其制备方法包括如下步骤：4、s1：脂肪干细胞外泌体的提取；5、s2：干细胞外泌体的封装；6、s3：外泌体中间层结构复合；7、s4：微胶囊外壳层凝胶结构负载。8、优选地，步骤s1中所述脂肪干细胞外泌体的提取步骤如下：9、c1：将人体脂肪干细胞加入dmem/f12培养基中悬浮，然后滴加到标准的组织培养板上，在温度37℃、5%co2的条件下培养，每隔1～2天更换一次dmem/f12培养基；将脂肪干细胞培养至融合度80%，加入0.25wt%的胰蛋白酶-edta溶液以降低细胞融合度进行消化传代，同时换用无血清培养基培养细胞24～48h，获得脂肪干细胞；10、c2：将步骤c1中获得的脂肪干细胞2000～5000rpm低速离心10min，取上清液以60w功率超声处理20～30min，用0.22μm的滤膜过滤，获得滤液；将滤液放入高速离心机中，控制转速8000～12000rpm，温度4℃离心30min，用300～1000kda的超滤膜过滤，pbs缓冲液洗涤，加入3wt%蔗糖，冷冻干燥，获得脂肪干细胞外泌体。11、优选地，步骤c1中所述人体脂肪干细胞在加入培养基前需利用含有1wt%青霉素的pbs缓冲液洗涤，其中青霉素浓度为90u/ml；所述人体脂肪干细胞浓度为1×106～3×106个/ml。12、优选地，步骤s2中所述干细胞外泌体的封装步骤如下：13、d1：将脂肪干细胞外泌体分散于pbs缓冲溶液中，混合均匀，获得10mg/ml外泌体溶液；将聚(丙烯酸-co-甲基丙烯酸)共聚物溶解在去离子水中，获得20mg/ml聚合物溶液；14、d2：将步骤d1中制备的外泌体溶液持续缓慢加入步骤d1中制备的聚合物溶液中，加入1wt%的戊二醇，利用hcl溶液和naoh溶液调节ph为6.5～7.4，室温下转速10000rpm高速搅拌30～60min，离心，pbs缓冲液洗涤，0℃真空冷冻干燥12～24h，获得外泌体微胶囊。15、优选地，步骤d1中所述所述聚(丙烯酸-co-甲基丙烯酸)共聚物是通过自由基聚合，以过氧化苯甲酰为引发剂，使丙烯酸和甲基丙烯酸按7:3的摩尔比混合制备获得。16、优选地，步骤d2中所述外泌体溶液和聚合物溶液的用量之比为1:3～10。17、优选地，步骤s3中所述外泌体中间层结构复合步骤如下：18、e1：将n-异丙基丙烯酰胺、过硫酸铵和n,n'-亚甲基双丙烯酰胺溶解在去离子水中，溶解均匀，获得混合溶液；以100ml/min的速度预充氮气10min后，加热混合溶液至70℃，以50～100ml/min的速度持续充入氮气，反应2～4h，冷却至室温，离心，20℃真空干燥12～24h，获得聚(n-异丙基丙烯酰胺)；19、e2：将步骤d2中制备外泌体微胶囊加入去离子水中制备为10mg/ml的微胶囊悬浮液，然后加入1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐和n-羟基琥珀酰亚胺，控制温度30℃，100rpm搅拌10～30min后，加入5mg/ml的赖氨酸溶液，控制温度30℃，150rpm搅拌10～30min，离心，过滤，去离子水洗涤，30℃真空干燥12～16h，获得改性微胶囊；20、e3：将步骤e1中制备的聚(n-异丙基丙烯酰胺)加入去离子水中制备为2wt%的聚(n-异丙基丙烯酰胺)溶液，将步骤e2中制备的改性微胶囊加入去离子水中制备为5mg/ml的改性微胶囊悬浮液；将聚(n-异丙基丙烯酰胺)溶液与改性微胶囊悬浮液混合，加入溶液总体积0.001%的纳米银颗粒，水浴加热控制温度32～35℃，200rpm搅拌30～60min，反应完成后冷却至室温，离心，过滤，去离子水洗涤，30℃真空干燥12～24h，获得外泌体复合微胶囊。21、优选地，步骤e1中所述n-异丙基丙烯酰胺、过硫酸铵、n,n'-亚甲基双丙烯酰胺和去离子水的用量比为1g:0.01～0.02g:0.01g:10ml。22、优选地，步骤e2中所述微胶囊悬浮液、1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐、n-羟基琥珀酰亚胺和赖氨酸的用量之比为1ml:0.5mg:0.4～0.5mg：10mg。23、优选地，步骤e3中所述聚(n-异丙基丙烯酰胺)溶液与改性微胶囊悬浮液的体积用量之比为1～5:1。24、优选地，步骤s4中所述微胶囊外壳层凝胶结构负载步骤如下：25、h1：将羧甲基壳聚糖和海藻酸钠分别溶解在去离子水中，制备为2wt%浓度的羧甲基壳聚糖溶液和海藻酸钠溶液；将步骤e3的外泌体复合微胶囊加入去离子水中制备为1mg/ml的外泌体复合微胶囊悬浮液；26、h2：将步骤h1制备的羧甲基壳聚糖溶液和海藻酸钠溶液以1:1的体积比例混合，控制温度4℃，300rpm搅拌15～25min，加入20wt%的步骤h1制备的外泌体复合微胶囊悬浮液和2倍体积的0.05mol/l的koh溶液，继续搅拌30min，在此过程中以0.1～1ml/min速度滴加2wt%的cacl2溶液，并用naoh溶液和hcl溶液保持ph为中性，反应结束，去离子水洗涤，-40℃冷冻干燥24h，获得外泌体微胶囊组合物。27、优选地，本发明的另一方面在于提供了一种富含脂肪干细胞外泌体的组合物的应用，所述外泌体组合物作为凝胶直接涂抹于清洁后的创伤表面，每天涂抹两次，两次涂抹时间间隔需大于8个小时。28、需要说明的是本发明制备的干细胞外泌体组合物凝胶应用主要用于提供伤口覆盖，为伤口提供保护性层，不能作为药物直接治愈伤口，主要作用为辅助伤口的自然恢复，提供一种有利于细胞增殖的环境。29、本发明中所用方法如无特殊说明，均为常规方法，所用材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。30、本发明的有益效果如下：31、本发明在制备外泌体微胶囊过程中，通过聚(丙烯酸-co-甲基丙烯酸)共聚物创建封装环境，这种环境不仅保护外泌体免受物理和化学损害，还具有ph敏感的特性，能在特定ph条件下(如ph值升高时)触发外泌体的控制释放，能够更加精准释放作用于皮肤特定部位。具体而言，在炎症过程中，皮肤上会聚集大量炎症细胞(如白细胞)，这些细胞释放的代谢产物会导致局部环境ph值的升高，同时，某些细菌的代谢活动也会导致伤口区域的ph值进一步升高；具体而言，本发明利用含有羧基(-cooh)的聚合物在酸性环境下不离子化，呈现出较低的亲水性；而在碱性环境下，羧基离子化为羧酸盐(-coo-)，增加材料的亲水性特性，导致材料溶胀和孔隙度的增加，进而有效实现外泌体的渐进释放。32、本发明在制备外泌体微胶囊的中间层结构过程中，通过添加赖氨酸引入正电荷，同时利用聚(n-异丙基丙烯酰胺)和纳米银颗粒来增强微胶囊的稳定性，并提供靶向细胞的能力；正电荷还有助于微胶囊与带负电荷的生物膜进行相互作用，从而提高吸附和渗透能力。与直接在微胶囊表面进行修饰相比于先制备中间层再进行外泌体封装可以更有效地实现修饰的均一性，大大简化了制备过程，使整个系统的制备更加直接高效。33、本发明还利用羧甲基壳聚糖和海藻酸钠制备了一种水凝胶负载骨架，以其优良的生物相容性和降解性有效避免了应激反应。通过使用cacl2进行交联，形成了一个稳定而具有一定强度的三维网络结构，不仅改善了其生物相容性，还有效避免了排斥反应。这种结构为外泌体提供了物理保护，防止其在外部环境中迅速降解或失活，从而在体内实现持续释放。水凝胶系统提供的局部化药物释放能够最大化地增加目标区域的药物浓度，同时减少对周围健康组织的影响。当与具有温度响应和ph双重响应性的微胶囊结构相结合时，这一系统可以持续有效地发挥作用。本发明中的外泌体微胶囊负载于水凝胶上，使水凝胶在水分蒸发时吸收热量，为皮肤提供清凉感，有效降低皮肤温度，减轻疼痛和灼热感，同时保持皮肤水分，对干燥受损的皮肤具有良好的保湿效果。