含Cas9/sgGDF15复合物的靶向肝癌的纳米胶囊及其制

本发明属于生物医药，具体涉及含cas9/sggdf15复合物的靶向肝癌的纳米胶囊的制备方法和其在肝癌治疗中的应用。背景技术：1、我国是肝癌高发国家，肝细胞癌(hepatocellular carcinoma，hcc)是原发性肝癌的主要病理类型，占75％-85％。2022年global cancer observatory数据库的统计数据显示，45.3％的肝癌新发病例及47.1％病死病例发生在我国。肝癌的治疗手段和疗效非常有限。早期的肝癌治疗以手术为主，但由于肝癌隐匿性强，多数患者首次诊断时即为中晚期，即使再进行手术切除，术后5年复发率也高达70％。中晚期的肝癌患者需进行以化疗和靶向治疗为主的全身系统治疗，但疗效十分有限。近年来，肝癌的免疫治疗发展迅速，在临床试验中获得了喜人疗效，但肝脏抑制性tme及其复杂机制也为肝癌免疫治疗的发展带来巨大的挑战。2、作为与炎症相关的恶性肿瘤，肝癌在其免疫治疗的基础研究与临床实践中均显示出了较好的反应结果。目前，免疫治疗在晚期肝癌治疗中的客观缓解率为20％左右，虽在总生存期延长上未达到理想效果，但积极作用值得肯定，为晚期肝癌患者带来了希望。肝脏作为免疫耐受器官，具有较为独特的tme，其内在作用机制复杂，为肝癌的免疫治疗带来了极大的挑战。3、脂质体是由磷脂双分子层自发形成的封闭小囊泡，与细胞膜结构相似，可以模拟细胞膜的性质，于20世纪60年代被bangham等人发现，最初是用作研究细胞膜结构和功能的简便模型，随着技术的进步和更深入的研究，脂质体逐渐发展为一种潜在的药物递送载体。由于其两亲性的结构，纳米胶囊可以携带多种不同的药物。亲水性药物可以封闭在脂质体的水性内部区域，而疏水性药物可以包裹在脂双层的烃链区域中。4、申请人前期(wo2021197171a1)首次证实gdf15可作为针对肝细胞癌的免疫治疗新靶点。使用单克隆抗体阻断gdf15可有效逆转肝癌tme的抑制性免疫状态，达到显著的抑瘤效果，且不会产生自身免疫反应副作用。但是单克隆抗体需要长期使用，不仅缺乏准确的肿瘤靶向性，还会产生不良反应，如抗药物抗体(ada)。技术实现思路1、为了克服上述现有技术的缺点，本发明的目在于提供含cas9/sggdf15复合物的靶向肝癌的纳米胶囊及其制备方法和应用。2、为了达到上述目的，本发明采用以下技术方案予以实现：3、本发明提供一种含cas9/sggdf15复合物的靶向肝癌的纳米胶囊，所述纳米胶囊包括含带负电荷cas9/sggdf15复合物的电中性纳米胶囊核和含sp94肝癌靶向肽的纳米胶囊壁；所述电中性纳米胶囊核由带正电荷的丙烯酸酯胍通过静电作用包封带负电荷cas9/sggdf15复合物获得；含sp94肝癌靶向肽的纳米胶囊壁由含双硫键交联剂与具有酰胺基和琥珀酸官能团的中性分子聚乙二醇聚合而成，纳米胶囊壁表面含有二硫键功能基团，所述二硫键功能基团与sp94肝癌靶向肽通过酰胺化反应连接。4、本发明所述含cas9/sggdf15复合物的靶向肝癌的纳米胶囊形貌为类球形，尺寸分布在80～160nm。5、本发明提供上述含cas9/sggdf15复合物的靶向肝癌的纳米胶囊的制备方法，包括以下步骤：6、(1)将带正电荷的cas9蛋白和带负电荷的sggdf15溶解，获得带负电荷的cas9/sggdf15复合物，加入带正电荷的丙烯酸酯胍溶液，获得电中性纳米胶囊核；7、(2)在步骤(1)所得电中性纳米胶囊核溶液体系中继续加入含酰胺基和琥珀酸官能团的中性分子聚乙二醇混匀后继续加入可降解交联剂、催化剂、引发剂聚合，形成包裹cas9/sggdf15复合物的纳米胶囊；8、(3)将sp94肝癌靶向肽加入步骤(2)所得纳米胶囊溶液中，与peg末端的nhs酰胺化反应，使胶囊表面连接上sp94多肽，获得含cas9/sggdf15复合物的靶向肝癌的纳米胶囊混合溶液；9、(4)加入缓冲液稀释步骤(3)所得混合溶液，经透析、除杂，冷冻干燥最终获得含cas9/sggdf15复合物的靶向肝癌的纳米胶囊。10、所述步骤(1)cas9/sggdf15复合物由摩尔比为1:1的sggdf15和cas 9蛋白溶于弱酸缓冲液获得，所述弱酸缓冲液为hepes缓冲液。11、所述sggdf15的基因序列如seq id no:1所示。12、所述步骤(1)带负电荷的cas9/sggdf15复合物和带正电荷的丙烯酸酯胍的摩尔比为1：10～15。13、所述步骤(3)交联剂为n,n’-双(丙烯酰)胱胺，所述引发剂为n，n，n'，n'-四甲基乙二胺，所述催化剂为过硫酸铵。14、所述步骤(3)所述含酰胺基和琥珀酸官能团的中性分子聚乙二醇为丙烯酸酯聚乙二醇琥珀酰亚胺基羧甲基酯。15、所述步骤(4)透析采用聚碳酸酯膜，孔径为30nm。16、本发明提供一种上述含cas9/sggdf15复合物的靶向肝癌的纳米胶囊在制备靶向肝癌药物中的应用。17、与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：18、本发明提供的一种含cas9/sggdf15复合物的靶向肝癌的纳米胶囊，通过构建表面含有二硫键的纳米胶囊，表面携带sp94靶向肽并包裹有cas9/sggdf15复合物，将该纳米胶囊转入细胞后可以达到敲除肝癌细胞gdf15基因的目的；在hepa1-6原位肝癌和质粒诱导的原发肝癌的小鼠肝癌模型中，该纳米胶囊经尾静脉注射4次后，小鼠的肿瘤体积显著缩小；免疫组化染色发现治疗组中肿瘤组织gdf15表达量明显降低、ki67表达量同样显著降低；t7e1酶切法和ngs测序法确定肿瘤的生长抑制是由gdf15基因敲除引起的；统计生存期发现，治疗组的小鼠生存时间显著延长；本发明纳米胶囊联合pd1抗体，二者具有协同抑制肝癌的作用，以上数据表明本发明含cas9/sggdf15复合物的靶向肝癌的纳米胶囊能够有效抑制小鼠肝癌的生长，显著延长小鼠生存期，为其在制备靶向肝癌药物中应用提供支持。19、本发明提供的含cas9/sggdf15复合物的靶向肝癌纳米胶囊的制备，通过在纳米胶囊表面加载肝癌靶向肽sp94，提高了纳米胶囊的肝癌靶向性；在纳米胶囊表面添加二硫键，使得纳米胶囊能够在肿瘤部位的高谷胱甘肽微环境中破裂，释放其中的包载的cas9和gdf15的sgrna，进而实现对肝癌细胞的gdf15的基因编辑，特异性敲除肝癌细胞内的gdf15基因，永久的逆转了肿瘤细胞内的免疫抑制性微环境，恢复了免疫细胞的抗肿瘤作用，达到了治疗肝癌的目的，规避传统疗法的重复剂量限制，降低治疗成本，提高治疗效果。因此，将cas9/sggdf15复合物递送至肝癌区域，敲除gdf15基因，逆转肝癌的抑制性免疫微环境成为一种潜在的临床治疗方案。技术特征：1.一种含cas9/sggdf15复合物的靶向肝癌的纳米胶囊，其特征在于，所述纳米胶囊包括含带负电荷cas9/sggdf15复合物的电中性纳米胶囊核和含sp94肝癌靶向肽的纳米胶囊壁。2.如权利要求1所述的含cas9/sggdf15复合物的靶向肝癌的纳米胶囊，其特征在于，所述含cas9/sggdf15复合物的靶向肝癌的纳米胶囊形貌为类球形，尺寸分布在80～160nm。3.一种含cas9/sggdf15复合物的靶向肝癌的纳米胶囊的制备方法，其特征在于，包括：带正电荷的丙烯酸酯胍通过静电作用包封带负电荷cas9/sggdf15复合物，获得电中性纳米胶囊核；含sp94肝癌靶向肽的纳米胶囊壁由含双硫键交联剂与具有酰胺基和琥珀酸官能团的中性分子聚乙二醇聚合而成，纳米胶囊壁表面含有二硫键功能基团，所述二硫键功能基团与sp94肝癌靶向肽通过酰胺化反应连接。4.根据权利要求3所述的含cas9/sggdf15复合物的靶向肝癌的纳米胶囊的制备方法，其特征在于，所述纳米胶囊核的制备：将带正电荷的cas9蛋白和带负电荷的sggdf15溶解，获得带负电荷的cas9/sggdf15复合物，加入带正电荷的丙烯酸酯胍溶液，获得电中性纳米胶囊核。5.根据权利要求4所述的含cas9/sggdf15复合物的靶向肝癌的纳米胶囊的制备方法，其特征在于，所述cas9/sggdf15复合物由摩尔比为1:1的sggdf15和cas 9蛋白溶于弱酸缓冲液获得，所述弱酸缓冲液为hepes缓冲液。6.根据权利要求4所述的含cas9/sggdf15复合物的靶向肝癌的纳米胶囊的制备方法，其特征在于，所述sggdf15的基因序列如seq id no:1所示。7.根据权利要求4所述的含cas9/sggdf15复合物的靶向肝癌的纳米胶囊的制备方法，其特征在于，所述带负电荷的cas9/sggdf15复合物和带正电荷的丙烯酸酯胍的摩尔比为1：10～15。8.根据权利要求3所述的含cas9/sggdf15复合物的靶向肝癌的纳米胶囊的制备方法，其特征在于，所述含双硫键交联剂为n,n’-双(丙烯酰)胱胺，所述含酰胺基和琥珀酸官能团的中性分子聚乙二醇为丙烯酸酯聚乙二醇琥珀酰亚胺基羧甲基酯。9.根据权利要求3所述的含cas9/sggdf15复合物的靶向肝癌的纳米胶囊的制备方法，其特征在于，所述聚合反应还包括引发剂n，n，n'，n'-四甲基乙二胺和催化剂过硫酸铵。10.一种如权利要求1所述的含cas9/sggdf15复合物的靶向肝癌的纳米胶囊在制备靶向肝癌药物中的应用。技术总结本发明公开了含Cas9/sgGDF15复合物的靶向肝癌的纳米胶囊，通过在纳米胶囊表面加载肝癌靶向肽SP94，提高了纳米胶囊的肝癌靶向性；在纳米胶囊表面添加二硫键，使得纳米胶囊能够在肿瘤部位的高谷胱甘肽微环境中破裂，释放其中的包载的Cas9和GDF15的sgRNA，进而实现对肝癌细胞的GDF15的基因编辑，特异性敲除肝癌细胞内的GDF15基因，永久的逆转了肿瘤细胞内的免疫抑制性微环境，恢复了免疫细胞的抗肿瘤作用，达到了治疗肝癌的目的，规避传统疗法的重复剂量限制，降低治疗成本，提高治疗效果。因此，将Cas9/sgGDF15复合物递送至肝癌区域，敲除GDF15基因，逆转肝癌的抑制性免疫微环境成为一种潜在的临床治疗方案。技术研发人员：何磊,李萌,张英起,顾锦涛,王昭维,杜海琛,于多,谢飞受保护的技术使用者：中国人民解放军空军军医大学技术研发日：技术公布日：2024/8/16