一种用于体内CAR-T制备的纳米体系构建及应用

本发明属于生物医药，涉及car-t药物制备，具体涉及一种用于体内car-t制备的纳米体系构建方法及应用。背景技术：1、嵌合抗原受体t细胞(chimeric antigen receptor t cells，car-t)是血液系统恶性肿瘤最具有前景的细胞免疫治疗手段之一，car中包含了特异性的抗体单链可变区片段，可不依赖mhc抗原递呈高效靶向地杀伤肿瘤细胞。截止目前，多项临床研究表明cd19car-t治疗复发/难治急性b淋巴细胞白血病(relapsed/refractory b-cell acutelymphoblastic leukemia,r/rb-all)的完全缓解率(complete remission,cr)为67％-93％(1.curran emily；o'brien maureen；role ofblinatumomab,inotuzumab,and car t-cells:which to choose and how to sequence for patients with relapseddisease.semin hematol 2020,57(3):157-163.)。2、然而，car-t治疗也有一定的局限性，首先是其繁琐的制备过程，需要从患者体内分离t细胞，然后进行car转染并扩增，最后回输进患者体内。整个体外制备周期需耗时2周左右。如此繁琐的体外制备过程使car-t疗法难以用于疾病快速进展的患者，英国的一项真实世界研究表明，26％b细胞非霍奇金淋巴瘤患者由于疾病的快速进展而未能接受car-t治疗(2.kuhnlandrea；roddie claire；kirkwoodamya.；tholouli eleni；menne tobias；patelamit；besley caroline；chaganti sridhar；sanderson robin；o'reilly maeve；norman jane；osborne wendy；blooradrian；lugthart sanne；malladi ram；patten pierse.m.；neill lorna；3、martinez-cibrian nuria；kennedy hannah；phillips elizabeth h.；jonesceri；sharplin kirsty；4、el-sharkawi dima；latifanne-louise；mathewamrith；uttenthal benjamin；stewart orla；5、marzolini mariaa.v.；townsendwilliam；cwynarski kate；ardeshna kirit；ardavanarzhang；robinson kate；pagliucaantonio；collins graham p.；johnsonroderick；mcmillanandrew；anational service for delivering cd19 car-tin largeb-cell lymphoma-the uk real-world experience.br j haematol 2022,198(3):492-502.)。同时，已经有多项研究表明缩短car-t体外制备时间可以增强记忆样t细胞比例，从而增强car-t体内扩增与白血病细胞杀伤能力(3.zhang cheng；he jiaping；liu li；wangjishi；wang sanbin；liu ligen；ge jian；gao lei；gao li；kong peiyan；liuyao；liujia；hanyu；zhangyongliang；sun zhe；ye xun；yin wenjie；sersch martina；shenlianjun；cao wei william；zhang xi；novel cd19 chimeric antigen receptor t cellsmanufactured next-day for acute lymphoblastic leukemia.blood cancer j 2022,12(6):96.)。其次，目前的car-t属于“私人定制”式产品，高度的个性化定制导致其价格昂贵，当下国内获批的car-t产品价格最低的是合源生物的纳基奥仑赛注射液，其定价依旧高达99.9万人民币/支。这些因素极大限制car-t在普通人群中的使用，惠及人群有限。此外，近期美国fda已收到自体car-t治疗后出现t细胞恶性肿瘤的报告，这与利用病毒随机插入car基因导致的插入突变密切相关(4.ghilardi guido；fraietta josepha.；gerson jamesn.；van deerlinvivianna m.；morrissette jennifer j.d.；caponetti gabriel c.；paruzzo luca；harris jaryse c.；chong elisea.；susanibaradaniya sandrap.；6、svoboda jakub；nasta sunitad.；ugwuanyi ositadimmah.；landsburg danielj.；fardella eugenio；waxmanadam j.；chong emeline r.；patel vrutti；pajarilloraymone；kulikovskaya irina；lieberman david b.；cohenadam d.；levine bruce l.；stadtmauer edwarda.；frey noelle v.；vogl dan t.；hexner elizabeth o.；bartastefan k.；porter david l.；garfallalfred l.；schuster stephen j.；june carl h.；ruellamarco；t-cell lymphoma and secondary primary malignancy riskaftercommercial car t-cell therapy.nat med 2024.)。因此，探索安全高效的体内car-t细胞制备技术既可以跳过繁琐的体外制备过程，降低car-t治疗费用的同时提高疾病快速进展患者对car-t疗法的可及性；又可以提高car-t细胞治疗的安全性，具有重要临床意义和广阔的应用前景。7、近年来，纳米材料进入快速发展期并为体内car-t细胞制备提供了强有力的技术支持。2022年science杂志报道通过脂质纳米颗粒(lipidnanoparticles，lnp)包裹抗成纤维细胞活化蛋白的mrna，成功实现体内制备car-t细胞并证明其可有效减少心肌损伤后的纤维化，恢复心脏功能(5.rurik joel g.；tombácz istván；yadegariamir；méndez fernández pedro o.；shewale swapnil v.；li li；kimura toru；soliman ousamahyounoss；papp tyler e.；tamying k.；mui barbara l.；albelda steven m.；puréellen；june carlh.；aghajanian haig；weissman drew；parhiz hamideh；epstein jonathana.；cart cellsproduced in vivo to treat cardiac injury.science 2022,375(6576):91-96.)。华东师范大学闫志强教授团队构建了包含il-6shrna的cd19 car质粒，然后利用lnp包裹car质粒实现car-t细胞体内制备的同时降低il-6的分泌，从而降低细胞因子释放综合征并提高car-t细胞治疗的安全性(6.zhou jing-e.；sun lei；jiayujie；wang zhehao；luotengshuo；tan jingwen；fang xiaoyan；zhu hongjia；wang jing；yu lei；yan zhiqiang；lipid nanoparticles produce chimeric antigen receptor t cells withinterleukin-6knockdown in vivo.j control release 2022,350:298-307.)。华南理工大学王均教授团队使用病毒模拟膜融合型纳米囊泡递送car蛋白，成功实现体内制备car-t细胞并证明了其良好的抗肿瘤活性(7.zhao gui；zhang yue；xu cong-fei；wang jun；invivo production ofcar-t cells using virus-mimetic fusogenic nanovesicles.scibull(beijing)2024,69(3):354-366.)。8、然而，这些研究使用的载体都比较复杂，对制备技术和工艺有较高的要求。聚(β-氨基酯)[poly(β-amino esters)，pβae]作为基因递送的纳米载体，具有多项优势：易合成且副产物少、易改造的骨架结构、良好的组织渗透性和内涵体逃逸能力、易降解毒性小，并且可以根据需要对其结构进行修饰，实现基因或药物的靶向递送(8.cordeirorosemeyrea.；serraarménio；coelho jorge f.j.；faneca henrique；poly(β-aminoester)-based gene delivery systems:from discovery to therapeuticapplications.j control release 2019,310:155-187.)。相较于利用病毒与lnp等载体制备car-t细胞的复杂性与高成本，利用pβae纳米材料实现体内car-t细胞制备工艺更简单、可批量生产、成本更低且安全性更高(9.parayath neha n.；stephan matthias t.；insitu programming ofcar t cells.annu rev biomed eng 2021,23:385-405.)。9、基于以上研究背景，本发明构建并优化了一种使用pβae聚合物纳米材料包裹carmrna的体内car-t制备体系，使car-t细胞成为一种“现货型”产品且具备大规模生产的可能，从而降低car-t治疗价格，提高患者对car-t疗法的可及性。同时，mrna无需整合t细胞基因组即可表达，提高了car-t治疗的安全性，具有重要临床意义和广阔的应用前景。技术实现思路1、本发明针对上述问题进行，提供了一种用于体内car-t制备的纳米体系构建方法。第一目的在于构建一种体内car-t制备的纳米体系；第二目的在于提供所述纳米体系的制备方法并优化纳米体系；第三目的在于将体内制备的car-t细胞用于治疗血液系统恶性肿瘤，尤其用于治疗急性b淋巴细胞白血病(b-all)。2、为了实现上述目的，本发明的技术方案概述如下：由于经典的pβae聚合物对悬浮细胞(人t淋巴白血病jurkat细胞)的转染效果不佳。本发明对pβae进行优化合成pβae-447，再次利用其以不同质量比包裹gfp mrna对jurkat细胞进行转染，分析不同质量比下的转染效率，同时分析pβae-447/mrna不同质量比时对t细胞的毒性，结合转染效率与细胞毒性确定最佳的转染体系。而后，通过多聚谷氨酸在pβae-447聚合物表面连接cd3抗体，增加纳米体系的t细胞靶向性。最后，利用优化的pβae-447纳米体系包裹car mrna转染t细胞，分析纳米制备的car-t细胞体内外对b-all的抗肿瘤活性。3、本发明的具体技术方案如下：4、本发明第一方面，提供了用于体内car-t制备的纳米体系构建方法，包括如下步骤：5、a、pβae-447制备6、本发明在探索体内car-t制备纳米体系的过程中，首先利用4-氨基-1-丁醇与1,4-丁二醇二丙烯酸酯反应合成了pβae聚合物材料，然后利用其以不同质量比包裹绿色荧光蛋白mrna(gfp mrna)，同时对293t细胞(易转染的贴壁细胞)与jurkat细胞(悬浮细胞)进行转染，发现其可以较好转染293t细胞但几乎不能转染jurkat细胞。7、基于此，本发明优化了pβae结构，将1-(3-氨基丙基)-4-甲基哌嗪与pβae反应合成了pβae-447，在pβae两端增加了叔胺基团从而增加了材料的内涵体逃逸功能，从而使pβae-447可以更好的包裹mrna实现转染。pβae与pβae-447的结构式如下所示：8、9、具体的，pβae的合成步骤如下：将4-氨基-1-丁醇与1,4-丁二醇二丙烯酸酯以摩尔比1:1.1混合后，95℃下反应12h；而后用大量冰乙醚沉淀，离心收集产物，真空干燥即得pβae产物。10、pβae-447制备步骤如下：将pβae溶于2ml四氢呋喃中制备浓度为1.15g/ml的pβae溶液，将1-(3-氨基丙基)-4-甲基哌嗪溶于thf中制备浓度为0.06g/ml的1-(3-氨基丙基)-4-甲基哌嗪溶液，将两种溶液混合后，在37℃搅拌2h得到pβae-447聚合物，其中，pβae溶液与1-(3-氨基丙基)-4-甲基哌嗪溶液混合后，pβae与1-(3-氨基丙基)-4-甲基哌嗪之间的质量比为2.5～3.5。而后pβae-447聚合物用5倍体积的乙醚沉淀，收集沉淀真空冷冻干燥，最后将收集到的聚合物溶解于二甲基亚砜中至浓度为100mg/ml，储存于-20℃。11、b、pβae-447包裹car mrna12、该部分用于优化pβae-447包裹mrna所组成的纳米体系。首先，在不同质量比下利用pβae-447包裹mrna，分析其在不同质量比下对jurkat细胞与t细胞的转染效率，同时利用cck-8实验分析不同质量比下纳米体系对t细胞的细胞毒性，根据转染效率与细胞毒性确定最佳的转染效率。13、具体的，用25mm醋酸钠将100mg/mlpβae447稀释为5mg/ml，1mg/ml car mrna稀释为0.1mg/ml，然后将5mg/ml的pβae447溶液和0.1mg/ml的car mrna溶液按照质量比为40～80:1混合后，室温孵育15min，并转染t细胞。14、4h后利用流式分析转染效率并换液继续观察转染效率的动态变化，结果显示当质量比为20时几乎不能实现转染，后随着质量比的提高转染效率逐渐升高，当质量比为80时可以较好的对jurkat细胞进行转染。后续进一步通过rna凝胶实验发现，pβae-447与mrna质量比为20时，不能完全包裹mrna。且随着质量比的增加，进样孔中mrna浓度度逐渐降低，说明pβae-447对mrna的包裹越来越好。15、体外t细胞毒性分析，从24h毒性结果可以看出，当质量比在80及以下时，pβae-447对t细胞无明显毒性。16、综合上述结果，将5mg/ml的pβae447溶液和0.1mg/ml的car mrna溶液按照质量比为40～80:1混合，优选80:1。17、c、纳米体系的t细胞靶向性构建18、在纳米表面通过多聚谷氨酸连接cd3抗体，增加了纳米体系的靶向性与转染效率。19、其中，pga-cd3抗体的制备方法如下：将多聚谷氨酸pga溶于水中至20mg/ml，然后在浴超声波仪中超声10分钟；加入等体积的4mg/ml n'-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺·hcl水溶液，并将该溶液在室温下混合5分钟。20、将得到的活化的pga以4:1的摩尔比加入到pbs溶解的cd3抗体溶液中，并在室温下混合6小时；而后对上述溶液透析24h除去过量的试剂，并通过40k zeba旋转柱过滤备用。21、本发明的第二方面，提供给了采用上述方法构建得到的用于体内car-t制备的纳米体系。22、本发明第三方面，提供了上述纳米体系在制备治疗血液系统恶性肿瘤药物中的应用，尤其在制备治疗急性b淋巴细胞白血病(b-all)药物中的应用。23、本发明具体实施方式部分中，先通过前期实验确定了pβae-447/mrna质量比为80时可较好转染t细胞并无明显毒性。后续我们将纳米体系制备的car-t功能进行了分析，发现其可以靶向杀伤肿瘤细胞且与体外病毒制备的car-t无显著差异。最后，我们将构建的纳米体系应用于b-all的应用中，发现体内可以完成car-t细胞的制备并有效杀伤肿瘤细胞，延长小鼠生存期，在治疗b-all中具有一定效果。24、优选的，上述纳米体系内包覆的carmrna为cd19 car基因，该cd19 car基因的引物序列如下seq id no.1和2所示：25、上游引物：ggattcgccagcctccac(seq id no.1)；26、下游引物：aaacttggctcttggagttgt(seq id no.2)。27、本发明第四方面，提供了一种治疗血液系统恶性肿瘤的药物组合物，优选治疗b-all的药物组合物，其包括上述所述的纳米体系，该纳米体系包覆的car mrna为cd19 car基因，该cd19 car基因的引物序列如上seq id no.1和2所示。28、本发明的作用与效果29、本发明构建的体内car-t制备纳米体系可以跳过现有跳过现有体外car-t繁琐的制备过程，使car-t成为一种“现货型”的活体药物并具备大规模生产的可能，从而降低治疗费用并提高患者对car-t疗法的可及性。此外，mrna不需要整合基因组，可以进一步避免现有car-t疗法潜在的致瘤风险，提高car-t治疗的安全性，具有一定的临床应用前景。