制备用于治疗花生过敏的耐受性纳米颗粒的制作

本公开涉及用于治疗花生过敏的包封花生蛋白的耐受性免疫修饰纳米颗粒的制备的方法。通过引用并入以电子方式提交的材料通过引用以其整体并入了与此同时提交并且标识如下的计算机可读核苷酸/氨基酸序列表：27,276字节的文件，命名为“57037_seqlisting.hml”；创建于2022年11月15日。背景技术：1、花生过敏是最常见的食物过敏之一，影响近1.2％的美国总人口和2.5％的儿童人口，其发病率在过去十年中呈上升趋势。1花生过敏是由病理性超免疫应答促使的，在这种情况下，接触花生会导致轻度至重度症状，如恶心、呕吐、皮疹、呼吸减弱、血压下降甚至死亡。2、对花生蛋白的过敏性免疫应答是由t细胞依赖性机制介导的，涉及2型t辅助应答的上调、导致花生蛋白特异性ige抗体产生的b细胞类别转换以及肥大细胞和嗜碱性粒细胞的脱粒。23、目前，还没有用于治愈花生过敏的方法，严格避免接触花生抗原和管理过敏反应是供患者可用的唯一选择。可以诱导t细胞对致敏花生蛋白耐受的免疫耐受疗法被认为是治疗花生过敏的金标准；然而，此类疗法难以捉摸。4、已经使用口服免疫疗法(oit)、皮下免疫疗法(scit)、表皮免疫疗法(epit)和舌下免疫疗法(slit)方法进行了开发免疫耐受疗法的尝试。3这些方法的成功与否是高度可变的，并且只有对花生蛋白的脱敏反应被报道，这只能防止意外暴露，但不能治愈。4-6此外，这些方法依赖于含有游离花生蛋白的调配物的长期施用。因此，由于游离致敏花生蛋白暴露于对这些过敏原预先存在敏感性的免疫系统，这些疗法在花生过敏患者中存在不良反应(包含过敏反应)的风险。6-7技术实现思路1、包含一种或多种抗原的耐受免疫修饰颗粒(timp)先前已被描述用于通过诱导抗原特异性免疫耐受来治疗免疫介导的病症(例如，自身免疫性疾病和过敏)(wo 2013192532和wo 2015023796，通过引用并入本文)。将花生蛋白封装在timp核内是一个优势，因为其确保了将封装的蛋白安全递送到apc，而不会诱导免疫激活(例如，通过暴露于ige)，从而降低花生过敏患者施用游离花生蛋白相关的不良反应(例如，过敏反应)的风险。2、timp-ppe的制造方法涉及许多步骤，其中的每个步骤都会影响所得组合物的理化性质，这对安全和治疗性施用至关重要。重要的是，必须优化该方法，以确保花生蛋白在颗粒核内的高效封装。3、本公开提供了一种用于制备组合物的方法，所述组合物包括包封花生蛋白的带负电荷的颗粒(timp-ppe)。所述方法涉及一种制造颗粒的方法，所述颗粒优化用于安全和治疗性施用timp-ppe以用于花生过敏的治疗。在各个实施例中，所述方法包括：(a)通过将花生蛋白(ppe)的水溶液与包含聚合物的油相混合来产生初级乳液；(b)将所述初级乳液与包含一种或多种表面活性剂和/或稳定剂的溶液混合以形成次级乳液；(c)通过蒸发使所述次级乳液硬化以去除溶剂，从而产生经硬化的聚合物纳米颗粒，所述经硬化的聚合物纳米颗粒将花生蛋白包封在其核内；(d)过滤、洗涤和浓集所述纳米颗粒；以及(e)冷冻干燥所述纳米颗粒。在各个实施例中，步骤(a)的所述初级乳液为油包水乳液。在各个实施例中，步骤(b)的所述次级乳液为水包油乳液。4、在各个实施例中，步骤(a)的所述水溶液包含溶剂。在各个实施例中，所述溶剂为有机溶剂。在各个实施例中，所述溶剂为无机溶剂。在各个实施例中，所述有机溶剂为二氯甲烷、丙酮、乙醇、二氯甲烷、二甲基亚砜(dmso)、乙酸乙酯、二甲基甲酰胺、四氢呋喃、氯仿和乙酸。在各个实施例中，所述无机溶剂为水、氨、硫酸、二硫化碳、三氟化溴、三氯氧磷、氟化氢和二氧化硫。在各个实施例中，所述水溶液中的所述溶剂的浓度为1％、2％、3％、5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％或50％(v/v)。在各个实施例中，所述水溶液中的所述溶剂的浓度为0.1mm、0.2mm、0.3mm、0.4mm、0.5mm、0.6mm、0.7mm、0.8mm、0.9mm、1.0mm、1.5mm、2mm、2.5mm、3mm、3.5mm、4mm、4.5mm、5mm、5.5mm、6mm、6.5mm、7.0mm、7.5mm、8.0mm、8.5mm、9.0mm或10.0mm。在各个实施例中，所述水溶液中的所述溶剂的浓度为0.1m、0.2m、0.3m、0.4m、0.5m、0.6m、0.7m、0.8m、0.9m、1.0m、1.5m、2m、2.5m、3m、3.5m、4m、4.5m、5m、5.5m、6m、6.5m、7.0m、7.5m、8.0m、8.5m、9.0m或10.0m。5、在各个实施例中，步骤(b)的所述表面活性剂和/或稳定剂溶液包含溶剂。在各个实施例中，所述溶剂为有机溶剂。在各个实施例中，所述溶剂为无机溶剂。在各个实施例中，所述有机溶剂为二氯甲烷、丙酮、乙醇、二氯甲烷、二甲基亚砜(dmso)、乙酸乙酯、二甲基甲酰胺、四氢呋喃、氯仿和乙酸。在各个实施例中，所述无机溶剂为水、氨、硫酸、二硫化碳、三氟化溴、三氯氧磷、氟化氢和二氧化硫。在各个实施例中，所述水溶液中的所述溶剂的浓度为1％、2％、3％、5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％或50％(v/v)。在各个实施例中，所述水溶液中的所述溶剂的浓度为0.1mm、0.2mm、0.3mm、0.4mm、0.5mm、0.6mm、0.7mm、0.8mm、0.9mm、1.0mm、1.5mm、2mm、2.5mm、3mm、3.5mm、4mm、4.5mm、5mm、5.5mm、6mm、6.5mm、7.0mm、7.5mm、8.0mm、8.5mm、9.0mm或10.0mm。在各个实施例中，所述水溶液中的所述溶剂的浓度为0.1m、0.2m、0.3m、0.4m、0.5m、0.6m、0.7m、0.8m、0.9m、1.0m、1.5m、2m、2.5m、3m、3.5m、4m、4.5m、5m、5.5m、6m、6.5m、7.0m、7.5m、8.0m、8.5m、9.0m或10.0m。在各个实施例中，步骤(a)和步骤(b)的所述溶液中的所述溶剂是相同的。在各个实施例中，步骤(a)和步骤(b)的所述溶液中的所述溶剂是不同的。6、在各个实施例中，步骤(a)的所述水溶液包含0.1mg/ml、0.2mg/ml、0.5mg/ml、1mg/ml、2mg/ml、3mg/ml、4mg/ml、5mg/ml、6mg/ml、7mg/ml、8mg/ml、9mg/ml、10mg/ml、15mg/ml、20mg/ml、25mg/ml、30mg/ml、35mg/ml、40mg/ml、45mg/ml、50mg/ml、55mg/ml、60mg/ml、65mg/ml、70mg/ml、75mg/ml、80mg/ml、85mg/ml、90mg/ml、95mg/ml或100mg/ml花生蛋白。在各个实施例中，通过混合0.5小时、1小时、2小时、3小时、4小时、5小时、6小时、7小时、8小时、9小时、10小时、11小时、12小时、13小时、14小时、15小时、16小时、17小时、18小时、19小时、20小时、21小时、22小时、23小时、24小时、48小时、72小时或96小时将所述花生蛋白溶解在所述水溶液中。在各个实施例中，在制造timp-ppe的方法中使用的花生蛋白从烤花生获得。在各个实施例中，花生蛋白从生花生中获得。在各个实施例中，用于制造timp-ppe的方法的所述花生蛋白是使用包括以下步骤的方法获得的：(a)将生花生磨成糊；(b)使所述花生糊脱脂；(c)干燥所述脱脂花生糊；(d)将所述干花生糊粉化；(e)用碳酸氢铵从所述花生粉中提取花生蛋白；以及(f)浓缩和澄清所述花生蛋白，得到纯化的花生提取物。在各个实施例中，进一步纯化所述经纯化的花生提取物以分离致敏花生蛋白。在各个实施例中，所述分离的致敏花生蛋白通过分级获得。在各个实施例中，所述致敏花生蛋白是ara h 1、ara h 2、ara h 3、ara h 4、ara h 5、ara h6、ara h 7、ara h 8、ara h 9、ara h 10、ara h 11、ara h 12、arah 13、ara h 14、ara h15、ara h 16、ara h 17和ara h 18。在各个实施例中，步骤(a)的水溶液含有来自致敏花生蛋白的肽。在各个实施例中，所述肽包括来自致敏花生蛋白ara h1、ara h 2、ara h 3、ara h 4、ara h 5、ara h6、ara h 7、ara h 8、ara h 9、ara h 10、arah 11、ara h 12、ara h 13、ara h 14、ara h15、ara h 16、ara h 17和ara h 18的致敏表位。在各个实施例中，所述肽从天然存在的花生蛋白获得。在各个实施例中，所述肽是合成制造的。在各个实施例中，所述肽通过固相肽合成或溶液相肽合成来制造。7、在各个实施例中，将步骤(a)中的所述经纯化的花生蛋白提取物溶解在溶剂中。在各个实施例中，所述溶剂为有机溶剂。在各个实施例中，所述溶剂为无机溶剂。在各个实施例中，将步骤(a)中使用的所述经纯化的花生蛋白提取物溶解在包括一种或多种酸和/或一种或多种碱的无机溶剂中。在各个实施例中，所述溶剂的ph介于1.0与14.0之间。在各个实施例中，所述ph为1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5、10.0、10.5、11.0、11.5、12.0、12.5、13.0、13.5、14.0，包含位于该范围内的所有值。在各个实施例中，所述溶剂为乙酸、硫酸、盐酸、硝酸、甲酸、苯甲酸、抗坏血酸、三氯乙酸、二氯乙酸、氯乙酸、三氟乙酸、氟乙酸、酒石酸、乳酸、葡萄糖酸、甲磺酸、乙磺酸、苯磺酸、对甲苯磺酸、三氟甲磺酸、聚苯乙烯磺酸、氢溴酸、氢碘酸、次氯酸、氯酸、氯酸、高氯酸、氟硫酸、氟锑酸、氟硼酸、六氟磷酸、铬酸、磷酸、氢氟酸、草酸、硼酸、碳酸、氢氧化钡、氢氧化钙、氢氧化铬、氢氧化钾、氢氧化铵、氢氧化锌、氢氧化钡、碳酸氢钠、甲胺、二乙胺、氢氧化钠、氢氧化镁、碳酸氢铵、氨、氢氧化铝、碳酸钠、氢氧化镁、氢氧化锌、氢氧化亚铁、丙酮、氢氧化锂、吡啶、氢氧化铷。在各个实施例中，所述溶剂浓度介于0.01％至100％(v/v)之间。在各个实施例中，所述溶剂的浓度为约0.01％、约0.05％、约0.1％、约0.2％、约0.3％、约0.4％、约0.5％、约0.6％、约0.7％、约0.8％、约0.9％、约1％、约10％、约25％、约50％、约75％、约99％、约100％(v/v)，包含位于该范围内的所有值。在各个实施例中，所述溶剂浓度介于0.1m至36m之间。在各个实施例中，所述溶剂浓度为约0.1m、约0.5m、约1m、约2m、约3m、约4m、约5m、约6m、约7m、约8m、约9m、约10m、约11m、约12m、约13m、约14m、约15m、约16m、约17m、约18m、约20m、约30m、约36m，包含位于该范围内的所有值。在各个实施例中，所述溶解的经纯化的花生提取物的浓度为约0.1mg/ml、约0.2mg/ml、约0.5mg/ml、约1mg/ml、约2mg/ml、约3mg/ml、约4mg/ml、约5mg/ml、约6mg/ml、约7mg/ml、约8mg/ml、约9mg/ml、约10mg/ml、约11mg/ml、约12mg/ml、约13mg/ml、约14mg/ml、约15mg/ml、约20mg/ml、约25mg/ml、约30mg/ml、约35mg/ml、约40mg/ml、约45mg/ml、约50mg/ml、约55mg/ml、约60mg/ml、约65mg/ml、约70mg/ml、约75mg/ml、约80mg/ml、约85mg/ml、约90mg/ml、约95mg/ml或约100mg/ml，包含位于该范围内的所有值。在各个实施例中，通过混合0.1小时、0.2小时、0.3小时、0.4小时、0.5小时、1小时、2小时、3小时、4小时、5小时、6小时、7小时、8小时、9小时、10小时、11小时、12小时、13小时、14小时、15小时、16小时、17小时、18小时、19小时、20小时、21小时、22小时、23小时、24小时、48小时、72小时或96小时将所述经纯化的花生蛋白提取物溶解在所述溶剂中。8、在各个实施例中，所述溶解的花生蛋白提取物的ph介于1.0与ph6之间，包含位于该范围内的所有值。在各个实施例中，所述溶解的花生蛋白提取物的ph为约ph 1至约ph 6、约ph 2至约ph 6、约ph 3至约ph 6、约ph 2至约ph 4，或约ph 1、约ph 1.5、约ph 2、约ph2.5、约ph 3、约ph 3.5、约ph 4、约ph 4.5、约ph 5、约ph 5.5或约ph 6。9、在各个实施例中，步骤(a)中的所述聚合物为可生物降解聚合物。在各个实施例中，所述可生物降解聚合物为聚乙醇酸(pga)、聚乳酸(pla)、聚癸二酸(psa)、聚(乳酸-共-乙醇酸)(plga)、聚(乳酸-共-癸二酸)(plsa)、聚(乙醇酸-共-癸二酸)(pgsa)、聚丙烯硫化物、聚(己内酯)、壳聚糖、多糖或脂质。在各个实施例中，所述聚合物为共聚物。在各个实施例中，所述共聚物具有不同的组成型聚合物摩尔比。在各个实施例中，所述摩尔比为25:75、30:70、35:65、40:60、45:55、50:50、55:45、60:40、65:35、70:30、75:25、80:20、81:19、82:18、83:17、84:16、85:15、86:14、87:13、88:12、89:11、90:10、91:9、92:8、93:7、94:6、95:5、96:4、97:3、98:2、99:1或100:0。10、在各个实施例中，步骤(a)中的所述聚合物为plga。在各个实施例中，plga的共聚物的所述摩尔比为25:75、30:70、35:65、40:60、45:55、50:50、55:45、60:40、65:35、70:30、75:25、80:20、81:19、82:18、83:17、84:16、85:15、86:14、87:13、88:12、89:11、90:10、91:9、92:8、93:7、94:6、95:5、96:4、97:3、98:2、99:1或100:0。在各个实施例中，所述plga具有高分子量。在各个实施例中，所述plga具有低分子量。在各个实施例中，所述plga的分子量介于10kda至10,000kda之间(例如，介于10kda、20kda、30kda、40kda、50kda、60kda、70kda、80kda、90kda、100kda、500kda、1000kda、2000kda、3000kda、4000kda、5000kda、6000kda、7000kda、8000kda、9000kda或10000kda之间，包含位于该范围内的所有值)。在各个实施例中，步骤(a)的所述溶液中的plga的量介于0.05重量％与100重量％之间(例如，介于0.05重量％、0.1重量％、0.2重量％、0.3重量％、0.4重量％、0.5重量％、0.6重量％、0.7重量％、0.8重量％、0.9重量％、1重量％、2重量％、3重量％、4重量％、5重量％、6重量％、7重量％、8重量％、9重量％、10重量％、20重量％、30重量％、40重量％、50重量％、60重量％、70重量％、80重量％、90重量％或100重量％之间，包含位于该范围内的所有值)。11、在各个实施例中，步骤(b)中的所述表面活性剂和/或稳定剂为阴离子的、阳离子的或非离子的。在各个实施例中，所述表面活性剂和/或稳定剂为泊洛沙姆(poloxamer)、多胺、聚乙二醇(peg)、tween-80、明胶、葡聚糖、普朗尼克(pluronic)l-63、普朗尼克f-68、普朗尼克188、普朗尼克f-127、聚乙烯醇(pva)、聚丙烯酸(paa)、甲基纤维素、卵磷脂、双十二烷基二甲基溴化铵(dmab)、聚(乙烯-alt-马来酸)(pema)、维生素e tpgs(d-a-生育酚聚乙二醇1000琥珀酸酯)、透明质酸、聚氨基酸(例如，赖氨酸、精氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸和半胱氨酸或其对映异构体的聚合物)、甲基纤维素、羟乙基纤维素、羟丙基纤维素、羟丙基甲基纤维素、明胶、胆酸钠、卡波姆(carbomer)或硫酸盐聚合物(例如，硫酸肝素、硫酸软骨素、岩藻多糖、石莼多糖和卡拉胶)。在各个实施例中，步骤(b)中的所述溶液中存在的所述表面活性剂和/或稳定剂的所述量介于0.05重量或体积％与100重量或体积％之间(例如，介于0.05重量或体积％、0.1重量或体积％、0.2重量或体积％、0.3重量或体积％、0.4重量或体积％、0.5重量或体积％、0.6重量或体积％、0.7重量或体积％、0.8重量或体积％、0.9重量或体积％、1重量或体积％、2重量或体积％、3重量或体积％、4重量或体积％、5重量或体积％、6重量或体积％、7重量或体积％、8重量或体积％、9重量或体积％、10重量或体积％、20重量或体积％、30重量或体积％、40重量或体积％、50重量或体积％、60重量或体积％、70,重量或体积％、80重量或体积％、90重量或体积％或100重量或体积％之间，包含位于该范围内的所有值)。在各个实施例中，所述表面活性剂和/或稳定剂的分子量介于0.1kda至10,000kda之间(例如，介于0.1kda、0.2kda、0.3kda、0.4kda、0.5kda、0.6kda、0.7kda、0.8kda、0.9kda、1kda、2kda、3kda、4kda、5kda、6kda、7kda、8kda、9kda、10kda、20kda、30kda、40kda、50kda、60kda、70kda、80kda、90kda、100kda、500kda、1000kda、2000kda、3000kda、4000kda、5000kda、6000kda、7000kda、8000kda、9000kda或10000kda之间，包含位于该范围内的所有值)。12、在各个实施例中，包含在(b)中形成水包油次级乳液的一种或多种表面活性剂和/或稳定剂的所述溶液的ph为约4或小于约4.0。在各个实施例中，所述水包油次级乳液的ph为约ph 1至约ph 4、约ph 2至约ph 4、约ph 3至约ph 4，或约ph 1、约ph 1.5、约ph 2、约ph2.5、约ph 3、约ph 3.5或约ph 4。13、在各个实施例中，所述方法包括：(a)通过将花生蛋白的水溶液与包含聚合物的油相混合产生油包水初级乳液来产生初级乳液；(b)将所述初级乳液与包含一种或多种表面活性剂和/或稳定剂的溶液混合以形成水包油次级乳液；(c)使所述次级乳液硬化以去除溶剂，从而产生聚合物纳米颗粒，所述聚合物纳米颗粒将ppe包封在其核内；(d)过滤、洗涤和浓集所述纳米颗粒；以及(e)冷冻干燥所述纳米颗粒。14、在各个实施例中，步骤(a)的所述油包水初级乳液是通过将花生蛋白的所述水溶液与包含聚合物的所述油相均质化获得的。在各个实施例中，均质化进行5秒、10秒、15秒、20秒、25秒、30秒、30秒、40秒、45秒、60秒、90秒、120秒、150秒、180秒、210秒、240秒、270秒、300秒、330秒、360秒、390秒、420秒、450秒、480秒、510秒、540秒、570秒、600秒、700秒、800秒、900秒或1000秒。在各个实施例中，步骤(b)的所述水包油次级乳液是通过将所述初级乳液与包含一种或多种表面活性剂和/或稳定剂的溶液均质化获得的。在各个实施例中，均质化进行5秒、10秒、15秒、20秒、25秒、30秒、30秒、40秒、45秒、60秒、90秒、120秒、150秒、180秒、210秒、240秒、270秒、300秒、330秒、360秒、390秒、420秒、450秒、480秒、510秒、540秒、570秒、600秒、700秒、800秒、900秒或1000秒。在各个实施例中，步骤(a)的所述油包水初级乳液是通过将花生蛋白的所述水溶液与包含聚合物的所述油相超声处理获得的。在各个实施例中，超声处理进行5秒、10秒、15秒、20秒、25秒、30秒、30秒、40秒、45秒、60秒、90秒、120秒、150秒、180秒、210秒、240秒、270秒、300秒、330秒、360秒、390秒、420秒、450秒、480秒、510秒、540秒、570秒或600秒。在各个实施例中，步骤(b)的所述水包油次级乳液是通过将所述初级乳液与包含一种或多种表面活性剂和/或稳定剂的溶液超声处理获得的。在各个实施例中，超声处理进行5秒、10秒、15秒、20秒、25秒、30秒、30秒、40秒、45秒、60秒、90秒、120秒、150秒、180秒、210秒、240秒、270秒、300秒、330秒、360秒、390秒、420秒、450秒、480秒、510秒、540秒、570秒或600秒。15、在各个实施例中，所述次级乳液通过蒸发硬化。在各个实施例中，所述蒸发为主动蒸发。在各个实施例中，所述蒸发为被动蒸发。在各个实施例中，所述主动蒸发为真空驱动蒸发。在各个实施例中，蒸发进行0.25小时、0.5小时、1小时、2小时、3小时、4小时、5小时、6小时、7小时、8小时、9小时、10小时、11小时、12小时、13小时、14小时、15小时、16小时、17小时、18小时、19小时、20小时、21小时、22小时、23小时、24小时、48小时、72小时或96小时。在各个实施例中，所述次级乳液通过蒸发硬化。在各个实施例中，所述蒸发为主动蒸发。在各个实施例中，所述蒸发为被动蒸发。在各个实施例中，所述主动蒸发使用搅拌或在真空下进行。在各个实施例中，所述主动蒸发在高压真空下进行。在各个实施例中，所述主动蒸发在低压真空下进行。在各个实施例中，蒸发进行0.25小时、0.5小时、1小时、2小时、3小时、4小时、5小时、6小时、7小时、8小时、9小时、10小时、11小时、12小时、13小时、14小时、15小时、16小时、17小时、18小时、19小时、20小时、21小时、22小时、23小时、24小时、48小时、72小时或96小时。在各个实施例中，所述蒸发在介于0.01mbar与1000mbar之间(例如，介于0.01mbar、0.02mbar、0.03mbar、0.04mbar、0.05mbar、0.1mbar、0.2mbar、0.3mbar、0.4mbar、0.5mbar、0.6mbar、0.7mbar、0.8mbar、0.9mbar、1mbar、2mbar、3mbar、4mbar、5mbar、6mbar、7mbar、8mbar、9mbar、10mbar、20mbar、30mbar、40mbar、50mbar、60mbar、70mbar、80mbar、90mbar、100mbar、150mbar、200mbar、250mbar、300mbar、350mbar、400mbar、450mbar、500mbar、550mbar、600mbar、650mbar、700mbar、750mbar、800mbar、850mbar、900mbar、950mbar或1000mbar之间，包含位于该范围内的所有值)的压力下进行。16、在各个实施例中，步骤(d)中的纳米颗粒的所述过滤、洗涤和浓集通过凝胶过滤、膜过滤、透析、离心、色谱法、密度梯度离心或其组合进行。17、本公开还考虑了一种制备组合物的方法，所述组合物包括包封花生蛋白的带负电timp(timp-ppe)。在各个实施例中，timp-ppe颗粒具有负ζ电位。在各个实施例中，所述timp-ppe颗粒的负ζ电位介于约-100mv至约0mv之间。在各个实施例中，所述颗粒的ζ电位为约-100mv至约-25mv、约-100mv至约-30mv、约-80mv至约-30mv、约-75mv至约-30mv、约-70mv至约-30mv、约-75mv至约-35mv、约-70mv至约-25mv、约-60mv至约-30mv、约-60mv至约-35mv或约-50mv至约-30mv。在各个实施例中，所述ζ电位为约-25mv、-30mv、-35mv、-40mv、-45mv、-50mv、-55mv、-60mv、-65mv、-70mv、-75mv、-80mv、-85mv、-90mv、-95mv或-100mv。18、在各个实施例中，所述timp-ppe颗粒的大小或直径介于0.05μm至约10μm之间。在各个实施例中，所述timp-ppe颗粒的直径介于0.1μm与约10μm之间。在各个实施例中，所述timp-ppe颗粒的直径介于0.1μm与约5μm之间。在各个实施例中，所述timp-ppe颗粒的直径介于0.1μm与约3μm之间。在各个实施例中，所述timp-ppe颗粒的直径介于0.3μm与约5μm之间。在各个实施例中，所述timp-ppe颗粒的直径为约0.3μm至约3μm。在各个实施例中，所述timp-ppe颗粒的直径介于约0.3μm至约1μm之间。在各个实施例中，所述timp-ppe颗粒的直径介于约0.4μm至约1μm之间。在各个实施例中，所述timp-ppe颗粒的直径为约100nm至10000nm、约100nm至5000nm、约100nm至3000nm、约100nm至2000nm、约300nm至5000nm、约300nm至3000nm、约300nm至1000nm、约300nm至800nm、约400nm至800nm或约200nm至700nm。在各个实施例中，所述timp-ppe颗粒的直径为约50nm、100nm、200nm、300nm、400nm、500nm、600nm、700nm、800nm、900nm、1000nm、1100nm、1200nm、1300nm、1400nm、1500nm或2000nm。在各个实施例中，所述带负电荷的颗粒的直径介于400nm至800nm之间。在各个实施例中，粒径的多分散指数(pdi)或异质性指数介于0.01与1.0之间(例如，0.01、0.02、0.03、0.04、0.05、0.06、0.07、0.08、0.09、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9和1，包含所述范围内的所有值)。19、在各个实施例中，所述颗粒具有均匀大小分布。在各个实施例中，所述颗粒具有均匀大小分布，其中所述颗粒中的至少90％的直径介于0.05μm与约10μm之间、介于0.1μm与约10μm之间、0.1μm与约5μm之间、0.1μm与约3μm之间、0.3μm与约5μm之间、0.3μm至约3μm之间。在各个实施例中，所述颗粒具有均匀大小分布，其中所述颗粒中的至少90％的直径为约100nm至10000nm、约100nm至5000nm、约100nm至3000nm、约100nm至2000nm、约300nm至5000nm、约300nm至3000nm、约300nm至1000nm、约300nm至800nm、约400nm至800nm或约200nm至700nm。在各个实施例中，所述timp-ppe颗粒的直径为约50nm、100nm、200nm、300nm、400nm、500nm、600nm、700nm、800nm、900nm、1000nm、1100nm、1200nm、1300nm、1400nm、1500nm或2000nm。在各个实施例中，所述颗粒具有均匀大小分布，其中所述颗粒中的至少50％的直径介于约0.05μm与约10μm之间、约0.1μm与约10μm之间、约0.1μm与约5μm之间、约0.1μm与约3μm之间、约0.3μm与约5μm之间以及约0.3μm与约3μm之间。在各个实施例中，所述颗粒具有均匀大小分布，其中所述颗粒中的至少50％的直径为约100nm至10000nm、约100nm至5000nm、约100nm至3000nm、约100nm至2000nm、约300nm至5000nm、约300nm至3000nm、约300nm至1000nm、约300nm至800nm、约400nm至800nm或约200nm至700nm。在各个实施例中，所述timp-ppe颗粒的直径为约50nm、100nm、200nm、300nm、400nm、500nm、600nm、700nm、800nm、900nm、1000nm、1100nm、1200nm、1300nm、1400nm、1500nm或2000nm。在各个实施例中，所述颗粒具有均匀大小分布，其中所述颗粒中的至少10％的直径介于约0.05μm与约10μm之间、约0.1μm与约10μm之间、约0.1μm与约5μm之间、约0.1μm与约3μm之间、约0.3μm与约5μm之间以及约0.3μm与约3μm之间。在各个实施例中，所述颗粒具有均匀大小分布，其中所述颗粒中的至少10％的直径为约100nm至10000nm、约100nm至5000nm、约100nm至3000nm、约100nm至2000nm、约300nm至5000nm、约300nm至3000nm、约300nm至1000nm、约300nm至800nm、约400nm至800nm或约200nm至700nm。在各个实施例中，所述timp-ppe颗粒的直径为约50nm、100nm、200nm、300nm、400nm、500nm、600nm、700nm、800nm、900nm、1000nm、1100nm、1200nm、1300nm、1400nm、1500nm或2000nm。20、在各个实施例中，本公开的发明提供了一种制备组合物的方法，所述组合物包括包封花生蛋白的带负电荷的颗粒(timp-ppe)。在各个实施例中，包封在timp-ppe组合物内的所述花生蛋白含量为0.1至100μg/mg。在各个实施例中，所述花生蛋白含量介于0.1至100μg/mg(例如，0.1、0.5、1、1.5、2、2.5、3、3.5、4、4.5、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95或100μg/mg)之间，包含位于这些值之间的所有值和范围。在各个实施例中，包封在timp-ppe组合物内的所述花生蛋白包含ara h蛋白。在各个实施例中，所述ara h蛋白为ara h 1、ara h 2、ara h 3、ara h 4、ara h 5、ara h6、ara h 7、ara h8、ara h 9、ara h 10、ara h 11、ara h12、ara h 13、ara h 14、ara h15、ara h 16、ara h17和ara h 18。在各个实施例中，所述timp-ppe组合物中的所述ara-h蛋白的任何一种或其组合的含量介于0.01至100μg/mg之间(例如，0.01、0.02、0.03、0.04、0.05、0.06、0.07、0.08、0.09、0.1、0.5、1、1.5、2、2.5、3、3.5、4、4.5、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95或100μg/mg，包含位于这些值之间的所有值和范围)。在各个实施例中，如本文所述的制备timp-ppe的方法产生介于1-100％之间(例如，1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、15％、20％、25％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％，包含位于这些值之间的所有值和范围)的包封效率。在各个实施例中，所述方法产生至少20％的包封效率。所述timp-ppe组合物中的所述花生蛋白含量可以通过文献中描述的方法测定，包含elisa、质谱、hplc、cbqca和蛋白质印迹。21、在各个实施例中，本公开提供了一种制备组合物的方法，所述组合物包括包封花生蛋白的带负电荷的颗粒(timp-ppe)，其中所述颗粒表面含有低水平的花生蛋白。在各个实施例中，所述颗粒表面大体上不含花生蛋白。在各个实施例中，所述颗粒的所述表面上存在的花生蛋白的量介于所述timp-ppe组合物的总蛋白含量的0-30％之间(例如，0％、1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、5％、16％、17％、18％、19％、20％、21％、22％、23％、24％、25％、26％、27％、28％、29％或30％，包含位于这些值之间的所有值和范围)。在各个实施例中，在其表面上含有花生蛋白的颗粒的频率介于阴性对照的0-30％之间(例如，0％、1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、5％、16％、17％、18％、19％、20％、21％、22％、23％、24％、25％、26％、27％、28％、29％或30％，包含位于这些值之间的所有值和范围)。在各个实施例中，在其表面上含有花生蛋白的颗粒的频率介于阳性对照的0-100％之间(例如，0％、1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％和100％，包含位于这些值之间的所有值和范围)。在各个实施例中，颗粒的表面上的花生蛋白的量是阴性对照的表面上的花生蛋白的量的0倍至10倍(例如，0倍、1倍、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍或10倍，包含位于这些值之间的所有值和范围)。在各个实施例中，颗粒的表面上的花生蛋白的量是阳性对照的表面上的花生蛋白的量的0倍至1/100(例如，0倍、1倍、1/2、1/3、1/4、1/5、1/6、1/7、1/8、1/9、1/10、1/20、1/30、1/40、1/50、1/60、1/70、1/80、1/90或1/100，包含位于这些值之间的所有值和范围)。在各个实施例中，使用先前描述的方法，如流式细胞术、质谱、elisa、cbqca和蛋白质印迹，测定其表面上具有花生蛋白的timp-ppe颗粒的数量。22、在各个实施例中，本公开提供了一种制备组合物的方法，所述组合物包括包封花生蛋白的带负电荷的颗粒(timp-ppe)，其中所述颗粒展示出低突释。在各个实施例中，所述颗粒没有展现出突释。在各个实施例中，所述颗粒突释介于0-75％之间(例如，0、1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％或75％，包含位于这些值之间的所有值和范围)。23、在各个实施例中，在步骤(e)中冷冻干燥之前将赋形剂添加到所述纳米颗粒组合物中。在各个实施例中，所述赋形剂为缓冲剂和/或冷冻保护剂。在各个实施例中，所述赋形剂选自由以下组成的组：蔗糖、甘露醇、海藻糖、山梨醇、葡聚糖、ficoll、葡聚糖70k、柠檬酸钠、乳糖、l-精氨酸或甘氨酸。在各个实施例中，在冷冻干燥之前添加到所述纳米颗粒组合物中的赋形剂的量介于0.05重量或体积％与100重量或体积％之间(例如，介于0.05重量或体积％、0.1重量或体积％、0.2重量或体积％、0.3重量或体积％、0.4重量或体积％、0.5重量或体积％、0.6重量或体积％、0.7重量或体积％、0.8重量或体积％、0.9重量或体积％、1重量或体积％、2重量或体积％、3重量或体积％、4重量或体积％、5重量或体积％、6重量或体积％、7重量或体积％、8重量或体积％、9重量或体积％、10重量或体积％、20重量或体积％、30重量或体积％、40重量或体积％、50重量或体积％、60重量或体积％、70,重量或体积％、80重量或体积％、90重量或体积％或100重量或体积％之间，包含位于该范围内的所有值)。在各个实施例中，在冷冻干燥之前添加到所述纳米颗粒组合物中的赋形剂的量为每克纳米颗粒介于0.01g与500g之间(例如，介于0.01g、0.02g、0.03g、0.04g、0.05g、0.1g、0.2g、0.3g、0.4g、0.5g、0.6g、0.7g、0.8g、0.9g、1g、2g、3g、4g、5g、6g、7g、8g、9g、10g、20g、30g、40g、50g、60g、70g、80g、90g、100g、150g、200g、250g、300g、350g、400g、450g或500g之间)。24、在各个实施例中，timp-ppe的所述制造批次大小可以按比例放大或缩小。在各个实施例中，所述制造批次大小介于0.01g至100kg之间。在各个实施例中，所述批次大小为0.01g、0.1g、10g、20g、40g、60g、80g、100g、160g、240g、320g、400g、480g、560g、640g、720g、800g、1000g、5kg、10kg、50kg或100kg，包含位于这些值之间的所有值和范围。25、本文考虑了通过本文所述的方法制备的包封花生蛋白的颗粒。还提供了一种组合物，其包括通过本文所述的方法制备的包封花生蛋白的颗粒。在各个实施例中，所述组合物进一步包括药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。在各个实施例中，所述药物组合物是无菌药物组合物。26、还提供了一种包括颗粒的调配物，所述颗粒包括花生蛋白提取物。在各个实施例中，timp-ppe的调配物或药物组合物含有包封经纯化的蛋白质提取物的带负电的颗粒和赋形剂。在各个实施例中，所述赋形剂选自由以下组成的组：蔗糖、甘露醇、海藻糖、山梨醇、葡聚糖、ficoll、葡聚糖70k、柠檬酸钠、乳糖、l-精氨酸或甘氨酸。在各个实施例中，timp-ppe调配物含有一至十一种赋形剂。在各个实施例中，timp-ppe调配物含有一种或多种、两种或更多种、三种或更多种、四种或更多种、五种或更多种、六种或或更多种、七种或更多种、八种或或更多种、九种或或更多种或十种或或更多种赋形剂。27、在各个实施例中，timp-ppe调配物含有包封经纯化的花生蛋白、蔗糖、甘露醇和柠檬酸钠的带负电的颗粒。在各个实施例中，所述timp-ppe调配物中的所述带负电的颗粒浓度介于1％至100％之间、介于20％至50％之间或介于30％至40％之间，包含位于这些值之间的所有范围和值。在各个实施例中，所述timp-ppe调配物中的所述带负电的颗粒浓度为约30％、约31％、约32％、约33％、约34％、约35％、约35.6％、约36％、约37％、约38％、约39％或约40％。28、在各个实施例中，所述timp-ppe调配物中的所述蔗糖浓度介于1％至100％之间、介于20％至50％之间或介于30％至40％之间，包含位于这些值之间的所有范围和值。在各个实施例中，所述timp-ppe调配物中的所述蔗糖浓度为约30％、约31％、约32％、约33％、约34％、约35％、约35.6％、约36％、约37％、约38％、约39％或约40％。29、在各个实施例中，所述timp-ppe调配物中的所述甘露醇浓度介于1％至100％之间、介于15％至35％之间或介于20％至30％之间，包含位于这些值之间的所有范围和值。在各个实施例中，所述timp-ppe调配物中的所述蔗糖浓度为约20％、约21％、约22％、约23％、约24％、约25％、约25％、约26％、约26.7％、约27％、约28％、约29％或约30％。30、在各个实施例中，所述柠檬酸钠浓度介于0.01％至25％之间或介于0.5％至3.5％之间，包含位于这些范围之间的所有范围和值。在各个实施例中，所述柠檬酸钠浓度为约0.5％、约1％、约1.5％、约2％、约2.1％、约2.5％、约3％或约3.5％。31、在各个实施例中，所述timp-ppe调配物中的所述经纯化的花生蛋白介于每毫克(mg)plga 0.3μg至30μg(微克)花生蛋白之间，或介于每mg plga 1μg至10μg花生蛋白之间，包含位于这些范围之间的所有范围和值。在各个实施例中，所述timp-ppe调配物中的所述经纯化的花生蛋白为每mg plga约1μg、约2μg、约3μg、约4μg、约5μg、约6μg、约7μg、约8μg、约9μg或约10μg花生蛋白。32、本公开提供了治疗受试者花生过敏的方法，所述方法包括向所述受试者施用本文所述的包封花生蛋白的颗粒。考虑了包括如本文所描述的用于治疗花生过敏的timp-ppe的组合物。在各个实施例中，本公开提供了包括如本文所描述的timp-ppe的组合物在制备用于治疗花生过敏的药物中的用途。33、应当理解，本文所描述的每个特征或实施例或组合是本发明的任何方面的非限制性说明性实例，并且因此意在可与本文所描述的任何其它特征或实施例或组合结合。例如，在用如“一个实施例”、“一些实施例”，“某些实施例”、“进一步的实施例”、“具体示例性实施例”和/或“另一实施例”的语言描述特征的情况下，这些类型的实施例中的每个实施例都是旨在与本文所描述的任何其它特征或特征组合结合的特征的非限制性实例，而不必列出每种可能的组合。此类特征或特征的组合适用于本发明的任何方面。在公开属于范围内的值的实例的情况下，这些实例中的任何实例都被考虑为范围的可能端点，此类端点之间的任何和所有数值都被考虑，并且上端点和下端点的任何和全部组合都被预想。