巨型细胞器的回收及其用途的制作方法

本发明涉及基于通过将细胞浸泡在特定的低渗水性介质中进行渗透溶胀以产生具有增加的表面积与体积比的超微米级溶胀的细胞内细胞器，随后进行适应性细胞膜裂解以从细胞中分离和回收稳定且具有功能的巨型细胞外细胞器囊泡(geov)的组合的新方法，以及这种巨型细胞外细胞器囊泡用于包括筛选蛋白质或外源分子或药物的活性的几种应用中的用途。背景技术：0、现有技术1、细胞生物学、生物化学、药物发现和发病机制的主要目标和限制是了解在给定的环境变化下每种细胞器会发生什么。了解蛋白质的确切定位，它们如何被招募并影响细胞器特性以及它们的功能是什么具有重要意义。细胞内蛋白质如离子通道或酶构成了例如基本的药理学药物靶标。如果细胞器(主要是双层结合的区室)的尺寸超过几微米，并且可以在宿主细胞外进行调节，那么就可以规避这些限制。2、目前提取细胞内碎片的方法通常基于通过裂解缓冲液(低渗缓冲液、缓冲液+表面活性剂分子)回收细胞膜碎片，然后进行匀浆步骤，从而获得纳米碎片(数百纳米大小)的组合。对于这种方法，不可能进行光学可视化和操作，因此需要长时间的纯化步骤来识别所期细胞器纳米碎片的存在，这使得工业应用变得困难。为了提取细胞器(线粒体、溶酶体、细胞核)的一个微碎片，已使用光镊、激光、afm、吸液管对细胞外科手术进行了大量实践。这些技术无法收集每种类型细胞器的微米级细胞器，并且一次只能收集每个细胞的一种细胞器，这使得工业应用变得困难。3、最近的研究表明，将2d培养细胞置于低渗缓冲液中几分钟会导致细胞器溶胀，而不会使细胞脱离其载体。在这些实验中，细胞保持完整，并仍然附着在其载体上，这也归功于其细胞外基质。因此，内部的细胞器受到限制，在大小和可及性方面没有展现出其全部潜力，在2d附着细胞中缺少空间(载体附着的细胞比可分离的细胞溶胀效率低)。细胞器也被捕获，因为破碎细胞质膜并在不将细胞器破碎成纳米碎片的情况下将其完全去除非常困难。4、一些出售细胞裂解试剂盒的公司开发了方案，该方案使用含有表面活性剂的轻微低渗的介质，然后通过使用肉眼可见的注射器(半径＞0.5mm)在高压(＞1巴)下对细胞进行剪切，导致细胞裂解5、(https：//www.thermofisher.com/sn/en/home/life-science/protein-biology/protein-biology-learning-center/protein-biology-resource-library/pierce-protein-methods/traditional-methods-cell-lysis.html；6、https：//www.sigmaaldrich.com/fr/fr/product/sigma/mcl1？gclid＝cjokcqjwok-hbhddarisafj6uggiweugjkbual-z q3z21w7hbtnbd z3iebrttugndz4nrzrfxdxwaaqm5ealw wcb).。这些试剂盒和经典方案在提取前不会形成巨型细胞内细胞器囊泡：它们的溶胀方案不足以产生稳定且具有功能的巨型细胞器囊泡，并且它们破坏质膜的剪切过程如此剧烈，以至于细胞器也破碎成细胞器的细胞外纳米碎片，从而可能损失其生化组成(腔内蛋白质和膜蛋白可能在该过程中松散)、活性、功能性和/或膜生物物理性质。7、因此，仍然需要从细胞中产生、提取和回收稳定且具有功能的巨型细胞器，其从其来源的胞质溶胶中释放，不被质膜包围，并且足够大(例如5μm至20μm)以用于工业和学术操作目的，也称为来自任何细胞的巨型细胞外细胞器囊泡。技术实现思路1、因此，本发明人建立了基于渗透、生物和物理化学微扰以及质膜靶向破裂方法的特定组合，以从细胞中产生、提取和回收稳定且具有功能的巨型细胞器，即产生巨型细胞外细胞器囊泡(geov)的方法。为此，本发明人开发了基于以下步骤的方法：(i)产生与原始形式相比具有增加的表面积与体积比的细胞内细胞器的渗透溶胀步骤，将细胞置于低渗水溶液中接触0.5分钟、3分钟、5分钟、7分钟、10分钟、15分钟、20分钟至30分钟，所述低渗水溶液的渗量为0.1mosm/l至100mosm/l、优选1mosm/l至50mosm/l、更优选5mosm/l至50mosm/l、最优选10mosm/l至40mosm/l；水性介质最终与化学物质结合，以增加细胞内细胞器囊泡(双层结合的区室)的大小，从而形成先前文献中从未报道的尺寸分布的经扩大的囊泡，称为巨型(细胞内)细胞器囊泡(giov)，并降低质膜裂解张力值；该步骤结束之后是(ii)使低渗水性介质产生来回运动以置换细胞的步骤，该运动速率为0.01m/s至10m/s，该运动进行0.01秒至10分钟；该步骤促进细胞的细胞骨架和细胞外基质的破坏，以降低质膜裂解张力并促使质膜在裂解后完全打开；然后是(iii)在10-4秒至100秒期间机械地增加(从10-3mn/m至5mn/m、优选从5.10-3mn/m至4mn/m、更优选从10-2mn/m至2mn/m、甚至更优选从10-2mn/m至1mn/m、最优选从5.10-2mn/m至0.75mn/m)来自步骤(i)或步骤(i)+步骤(ii)的细胞的细胞质膜张力的步骤，从而使其质膜裂解并完全去除，并在低渗介质中释放稳定且具有功能的巨型细胞外细胞器囊泡(geov)，而不裂解它们，其平均大小通常为约5μm至20μm，表面积与体积比(表面积除以几何形状的体积，在大多数情况下为球形)为3μm-1至0.15μm-1、优选2μm-1至0.15μm-1、更优选1.5μm-1至0.15μm-1、最优选1.2μm-1至0.15μm-1。例如，geov具有增大的表面积与体积比，通常为1.2μm-1(尺寸>5μm)至0.3μm-1(尺寸<20μm)。总之，在整个方案中，强渗透冲击可以产生巨型细胞内囊泡并特异性地破坏细胞质膜的稳定性，然后只需要小的机械微扰就可以完全破碎并释放未被破碎的巨型细胞外细胞器囊泡，这归功于我们为质膜裂解和去除开发的方案。2、根据本发明，术语“巨型细胞外细胞器囊泡”(geov)是指从宿主细胞中产生、提取和收集的溶胀的双层结合的细胞器，作为囊泡(具有双层结合的内腔)，从包围其的质膜中释放；其平均表面积与体积比s/v为3μm-1至0.15μm-1、优选2μm-1至0.15μm-1、更优选1.5μm-1至0.15μm-1、最优选1.2μm-1至0.15μm-1。这对应于约2μm至40μm、优选3μm至40μm、更优选4μm至40μm、最优选5μm至40μm的平均尺寸。这种巨型细胞外细胞器囊泡来源于选自内质网、线粒体、溶酶体、高尔基体、液泡、叶绿体、自噬体、自噬溶酶体、内体、过氧化物酶体、多泡体的细胞器。这种巨型细胞外细胞器囊泡的膜和腔都由蛋白质、脂质和代谢物组成。这种巨型细胞外细胞器囊泡的生化物质总量是产生它们的细胞器总组成的一部分。这一部分至少大于0.01％、优选大于0.1％、更优选大于1％、最优选大于10％。这种巨型细胞外细胞器囊泡是在与其他geov没有、只有一次或有几次接触的情况下产生的。产生的这种巨型细胞器囊泡与细胞组成如胞质溶胶生物分子、微管、肌动蛋白、细丝、细胞核、脂滴、核糖体、中心粒、质膜没有、只有一次或有几次接触。3、本发明的巨型细胞外细胞器囊泡现在使得转向以前对工业参与者不可想象的应用成为可能。此外，这种巨型细胞器囊泡之间的接触可以被保留。另一优点是快速分离易于用显微镜(例如约5μm至20μm大小)成像的巨型细胞器囊泡，这例如允许快速量化药物相互作用和/或对蛋白质活性的影响。与本领域中必须浓缩细胞器碎片然后进行一些生物化学定量的其他技术相比，这简化了该过程。4、这种巨型细胞外细胞器囊泡是具有功能的，可以被标记，其上有任何想要的蛋白质，并且可以很容易地被挑选和操纵。因此，该技术能够产生巨型细胞外细胞器囊泡，这些囊泡可用于多种应用，包括筛选膜/腔内的蛋白质活性和/或外源分子或药物的作用。在药物r&d领域，这种活性可以在药物存在或不存在的情况下进行测量。其涉及膜和可溶性蛋白质或酶，如离子通道、核糖体等。在全球范围内，该技术首次提供了绘制药物-细胞器相互作用图的可能性，以确定与定位于特定细胞器的蛋白质相互作用的候选药物的选择性/特异性和/或毒性。5、因此，本发明涉及从任何细胞中产生巨型细胞外细胞器囊泡的方法，所述方法包括：6、a)将细胞与渗量为0.1mosm/l至100mosm/l的低渗水性介质接触0.5分钟至30分钟，以溶胀细胞及其细胞内双层结合的细胞器两者，破坏细胞的细胞骨架和细胞外基质两者，使细胞球形化；7、b)在10-4秒至100秒期间对细胞施加10-3mn/m至5mn/m的膜张力，用于裂解和去除细胞质膜；8、c)在低渗水性介质中回收巨型细胞外细胞器囊泡。9、根据本发明方法的具体实施方案，从中获得巨型细胞外细胞器囊泡的细胞可以在载体上培养或在本领域熟知的任何合适的培养基中批量悬浮培养，或者可以从类器官、组织、器官或生物体中回收。根据本发明的方法，任何类型的细胞(哺乳动物、植物或细菌细胞)都可以用于产生巨型细胞器。例如，从市场、实验室和医院患者获得的源自cos7、huh的细胞、哺乳动物细胞、人类细胞、肿瘤细胞。10、根据本发明方法的具体实施方案，步骤a)使用低渗水性介质进行0.5分钟、3分钟、5分钟、7分钟、10分钟、15分钟、20分钟至30分钟，所述低渗水性介质是渗量为0.1mosm/l至100mosm/l、优选1mosm/l至50mosm/l、更优选5mosm/l至50mosm/l、最优选10mosm/l至40mosm的任何水溶液，所述低渗水性介质源自例如缓冲溶液(经稀释的dpbs)、经稀释的细胞培养基(dmem)、离子溶液、盐溶液(如cacl2或kcl溶液)、经稀释的缓冲液、水等，用于产生稳定且具有功能的巨型细胞器囊泡。因此，例如，对于cos-7细胞，细胞质渗量为约300mosm/l，这意味着渗量低于约100mosm/l且高于0.1mosm/l的所有类型的水溶液都可以用于产生巨型细胞器囊泡。这种低渗水性介质能够立即对细胞及其细胞内细胞器施加足够的非破坏性、快速和有效的渗透冲击，以产生球形的溶胀细胞和经扩大的细胞器囊泡。否则，溶胀方案太长且无效，导致非球形区室和蛋白质降解，从而导致不可能产生geov。溶胀动力学参数的控制对于巨型细胞外细胞器囊泡的产生至关重要。11、一些添加的分子(细胞骨架破坏剂，如诺考达唑、诺维本、红海海绵素a、红海海绵素b、细胞松弛素；驱动蛋白、肌球蛋白和动力蛋白抑制剂如布比他汀、苄基甲苯磺酰胺、丁二酮肟)也允许分解细胞骨架并降低细胞的裂解张力。这种低渗水性介质确保在大多数情况下，细胞裂解后，细胞内区室将由细胞器形成巨型细胞外球形囊泡，其大小和表面积与体积比是现有技术的方法从未达到的。因此，本发明方法的低渗介质还可以包含一种或多于一种分子以调节巨型细胞外细胞器囊泡的表面积与体积比分布，同时防止其降解并调节裂解质膜的表面张力值(例如蛋白酶抑制剂、分子马达抑制剂、细胞器-细胞骨架接触抑制剂、细胞骨架破坏剂、表面活性剂)。一些添加的分子(例如离子通道调节剂/阻滞剂：毒胡萝卜素、咖啡因、苯并硫氮杂卓；细胞外基质干扰剂，如胰蛋白酶；蛋白质转运抑制剂；蛋白信号抑制剂，如光溜海绵素；化学表面活性剂如曲拉通-x-100、辛基葡萄糖苷、ddm、羧酸)使细胞溶胀得更快，从而更快地降低所产生的巨型细胞外细胞器囊泡的表面积与体积比。最后，细胞溶胀动力学不仅对减少步骤b)裂解细胞质膜的输入能量至关重要，而且对控制步骤c)结束时产生的geov的大小也至关重要。12、根据本发明方法的具体实施方案，低渗水性介质包含一种或多于一种选自以下的分子：诺考达唑、红海海绵素、胰蛋白酶、米沙基内酯(misakinolide)、菌丝内酯(mycalolide)、阿普罗林内酯(aplyronide)、长春花碱、鱼藤酮、猪苓内酯、茉莉花内酯、长春新碱、脱碳秋水仙碱、细胞松弛素、秋水仙碱、长春花生物碱、二氢吡啶、苯基烷基胺、苯并硫氮杂卓、加巴喷丁类、布比他汀、苄基甲苯磺酰胺、丁二酮一肟、毒胡萝卜素、光溜海绵素、曲拉通-x-100、吐温、sds、brij、辛基葡糖苷、辛基硫代葡糖苷、chaps、chapso、镁，所述分子在步骤a)之前、在步骤a)、a’)、b)和/或c)中加入。13、根据本发明方法的具体实施方案，在产生巨型细胞外细胞器囊泡之前，可以用分子处理细胞以防止蛋白质降解、调节细胞器上的生化反应等，这样巨型细胞外细胞器囊泡就可以具有特定的生化特性。因此，在步骤b)之前，可以通过化学物质和/或通过改变影响细胞和/或其细胞器的结构和/或代谢条件的蛋白质的表达水平来进一步改变细胞及其细胞器的代谢条件和结构。事实上，在步骤a)之前，可以用化学物质处理细胞或对细胞进行修饰，以过表达或抑制会影响细胞及其细胞器的结构(特别是表面积与体积比和细胞器彼此之间的相对位置)和代谢条件的一些蛋白质的水平。这些操作能够控制经回收的巨型细胞外细胞器囊泡的大小及其接触：在渗透溶胀之前调节表面积与体积比，通过适应性渗透溶胀来影响未来回收的巨型细胞器大小。例如，在诱导渗透溶胀之前，可以(1)通过改变影响细胞器形状和与其他细胞器、质膜和细胞骨架接触位点的蛋白质的表达水平，(2)通过用改变以下的分子处理细胞：细胞骨架和分子马达两者、细胞器接触位点(与其他细胞器、质膜和细胞骨架)、位于质膜和细胞器上的分子转运蛋白活性，信号蛋白活性，(3)通过改变影响细胞器的数量和形状、表面的细胞代谢途径，(4)介导细胞器表面积与体积比和细胞器间接触的变化的任何处理来调节未来产生的巨型细胞外细胞器囊泡的表面积与体积比。例如，在巨型细胞外细胞器囊泡产生和回收之前过表达climp63导致从内质网发出的较大的巨型细胞外细胞器囊泡的尺寸大于30μm。以同样的方式，在巨型细胞外细胞器囊泡产生和回收之前过表达mfn2导致从线粒体发出的较大的巨型细胞外细胞器囊泡的表面积与体积比小于0.75μm-1。在溶胀前1分钟至90分钟用诺考达唑(或红海海绵素a)预处理细胞可以使内质网形成更大的巨型细胞器。在溶胀形成前12小时至24小时添加雷帕霉素允许从内体、溶酶体、自噬溶酶体和多泡体形成更大的巨型细胞外细胞器囊泡。在溶胀和提取前加入巴佛洛霉素(bafylomicin)还可以获得更多来自自噬体的巨型细胞外细胞器囊泡。14、根据本发明方法的具体实施方案，所述方法在步骤a)之后和步骤b)之前还包括步骤a’)，该步骤a’)包括在约0.01秒至10分钟内使低渗水性介质产生来回运动以置换细胞，运动速率为约0.01m/s至10m/s，从而破坏细胞的细胞骨架和细胞外基质。因此，应用于步骤a)的溶胀细胞的该任选步骤a’)允许在步骤b)中进一步施加不太重要的拉伸膜张力来裂解细胞、完全打开细胞并释放geov而不裂解它们。这是因为细胞骨架赋予了细胞膜额外的抵抗力。因此，当来自步骤a)的溶胀细胞和细胞器没有经受这种运动时，步骤b)中所需的平均裂解张力为约7mn/m(如实施例所示，一些细胞在约1mn/m以下裂解，另一些在约10mn/m处裂解)，而对于在步骤a’)中经受这种运动的来自步骤a)的溶胀细胞和细胞器，步骤b)中所需的平均裂解张力为约2mn/m(如实施例所示，大多数细胞在1mn/m以下的张力下裂解)。因此，在不裂解细胞的情况下使细胞运动，可以进一步降低裂解张力，而不会破坏仍在细胞内的巨型(细胞内)细胞器囊泡。在文献中，膜破裂几乎总是与细胞裂解有关。在本发明的方法中，细胞裂解导致所有或几乎所有细胞内容物(包括细胞器)释放至细胞外介质中。现有技术并没有显示膜破裂后会发生什么，并且因为没有细胞内化合物的释放而误用了术语细胞裂解。事实上，质膜破裂导致囊泡形成或打开的双层孔关闭的现象是非常常见的。在这些情况下，尽管现有技术提到了质膜破裂和/或细胞裂解测量的术语，但细胞器从未被释放。这并不是因为存在膜破裂和/或细胞裂解，细胞内容物被释放。本发明的方法允许显著降低(≤2mn/m)膜张力以达到细胞裂解，去除整个质膜并从细胞中释放所有或几乎所有geov(如实施例1所示)，由于温和裂解而不裂解它们。15、根据本发明方法的具体实施方案，进行步骤b)以在10-4秒至100秒期间对细胞施加10-3mn/m至5mn/m、优选5.10-3mn/m至4mn/m、更优选10-2mn/m至2mn/m、甚至更优选10-2mn/m至1mn/m、最优选5.10-2mn/m至0.75mn/m的拉伸膜张力(双层张力)，从而在保持低渗水性介质中裂解细胞释放的巨型(细胞外)细胞器囊泡的结构的同时快速破碎细胞质膜。通常，本发明的方法允许将拉伸膜张力降低至小于约2mn/m的值，以将geov提取并回收至介质中。然而，当现有技术中已知的用于裂解细胞的通常拉伸膜张力平均高于5mn/m时，所有细胞器都碎裂成细胞外纳米囊泡，这些囊泡将其内容物释放至介质中，因此与所要求保护的geov不同，其不再是可操作的。步骤b)可以通过使用：机械力(例如抽吸压力、拉伸、剪切或声波)、化学试剂和/或表面活性剂、电场或激光(光)激发来进行。例如，用微量移液器(半径为约0.5μm至20μm)施加机械力，其抽吸压力通常为约0.1毫巴至600毫巴并更优选约5毫巴至200毫巴(其中以前的大部分技术使用的压力远大于1巴)，该压力在细胞上产生预期的拉伸膜张力，并导致质膜裂解和巨型细胞外细胞器囊泡回收(参见实施例部分)。例如，在根据本发明方法的步骤a)的细胞溶胀和巨型细胞内细胞器囊泡形成之后，在几秒钟(例如0.1秒至100秒)内施加范围在超声范围内(优选约16khz至1000khz、更优选约20khz至400khz)的声场(压力波)允许在细胞上产生预期的拉伸膜张力，并导致质膜裂解和巨型细胞外细胞器囊泡回收(参见实施例部分)。例如，在根据本发明方法的步骤a)的细胞溶胀和巨型细胞内细胞器囊泡形成之后，可以以控制的方式加入用作表面活性剂的化学物质，以在细胞上产生预期的拉伸膜张力，导致质膜裂解和巨型细胞外细胞器囊泡回收，例如羧酸(浓度足以使质膜裂解)、曲拉通x、吐温、sds、brij、辛基葡糖苷、辛基硫代葡糖苷、chaps、chapso等。使用表面活性剂会改变巨型细胞器的特性(参见实施例部分)。16、根据本发明的方法，可以而在没有任何标记的情况下从步骤c)中回收巨型细胞外细胞器囊泡，并随后通过使用包括光学、形态学、机械方法的几种非侵入性方法进行分选。然而，根据本发明方法的具体实施方案，步骤a)的细胞可以包括用至少一种细胞器蛋白标志物或报告细胞器的接受分子转染以促进细胞器鉴定的细胞。例如，用至少一种细胞器蛋白转染细胞，所述细胞器蛋白在溶胀前后用荧光或化学标志物标记。例如，kdel标记er腔，tom20标记线粒体，lc3b标记自噬体，lampl标记溶酶体，golgi7标记高尔基体。17、本发明还涉及通过本发明的方法获得的巨型细胞外细胞器囊泡，其特征在于，所述巨型细胞外细胞器囊泡：18、a)具有双层结合的内腔体积；具有至少小于3μm-1、2μm-1、1.5μm-1、1.2μm-1、1μm-1、0.85μm-1、0.75μm-1、0.66μm-1、0.6μm-1、0.5μm-1、0.42μm-1、0.38μm-1、0.33μm-1、0.28μm-1、0.25μm-1、0.2μm-1、0.15μm-1的表面积与体积比。19、b)由源细胞的细胞器产生，包括内质网、线粒体、溶酶体、高尔基体、液泡、叶绿体、自噬溶酶体、自噬溶酶体、内体、过氧化物酶体、多泡体。20、c)不被产生它们的源细胞的质膜包围；这意味着geov位于细胞外介质中。21、d)具有由蛋白质、脂质和代谢物组成的膜和腔。这种生化组成是产生geov的细胞器总组成的一部分。该一部分至少大于0.01％、0.1％、0.5％、1％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、90％、100％。22、e)具有至少大于5μm3、15μm3、30μm3、60μm3、100μm3、180μm3、260μm3、380μm3、520μm3、1000μm3、1500μm3、2000μm3、3000μm3、4500μm3的体积。23、f)在所有空间方向上具有至少大于2μm、3μm、4μm、5μm、6μm、7μm、8μm、9μm、10μm、12μm、14μm、16μm、18μm、20μm的尺寸。24、g)与其他geov没有、有一个或几个接触。25、h)与细胞组成如胞质溶胶生物分子、微管、肌动蛋白、丝、细胞核、脂滴、核糖体、中心粒、过氧化物酶体、质膜和其他细胞器没有、有一种或几种接触。26、本发明的巨型细胞外细胞器囊泡可以与任何类型的目的蛋白质一起回收，与不同的细胞组成或其他geov接触(如图4a至c所示)。首次生产和操纵这些细胞外复合结构可以以新的方式研究细胞组成之间的细胞器相互作用以及细胞内蛋白质和脂质的作用。利用这种geov复合结构可以开发药物发现、靶标和生物标志物识别方面的新应用。27、本发明的巨型细胞外细胞器囊泡的功能进一步特征在于所述geov转运中性物质和离子(膜转运蛋白活性为参考细胞例如源细胞中膜转运蛋白活性的至少0.1％、1％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％)；包括范围为参考细胞(例如源细胞)中膜转运活性的至少0.1％、1％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％的蛋白质活性。本发明的巨型细胞外细胞器囊泡可以储存，并在之后用于研究目的。本发明的巨型细胞外囊泡在低于4℃、或-20℃、或-80℃的温度下稳定至少1小时、2小时、3小时、6小时或12小时；1天、2天、3天、4天、5天或6天；1周、2周、3周或4周；1个月、2个月、3个月或6个月；或者1年、2年、3年、4年或5年。28、本发明还涉及筛选目标分子活性的方法，所述方法包括：29、a)将本发明的至少一种类型的巨型细胞外细胞器囊泡与目标分子接触；30、b)通过目标分子与所述至少一种类型的巨型细胞外细胞器囊泡流的相互作用来测量目标分子的活性调节。31、c)任选地将步骤b)中测量的活性与目标分子在任何接触之前的初始活性进行比较。32、因此，本发明的筛选方法能够测量目标分子与巨型细胞外细胞器囊泡上的至少一种蛋白质相互作用的能力；例如用至少一种通过本发明获得的定位于巨型细胞外细胞器囊泡上的蛋白质来筛选任何候选药物的功效、亲和力、选择性、特异性、毒性、生物可降解性、药物代谢动力学、渗透性。此外，本发明的方法还能够，例如，调节巨型细胞外细胞器囊泡之间的接触通讯，识别靶向巨型细胞外细胞器囊泡的分子，测试阻断巨型细胞外细胞器囊泡活性的分子的毒性。因此，这将使直接从健康/患病患者体内提取的巨型细胞外细胞器囊泡实现精确医疗和早期诊断。33、本发明还涉及根据本发明的至少一种类型的巨型细胞外细胞器囊泡用于筛选目标分子的活性的用途。因此，在产生和回收巨型细胞外细胞器囊泡之前，可以评估化合物例如药物、蛋白质(例如，与疾病有关的)或离子对本发明的所述至少一种类型的巨型细胞外细胞器囊泡的相互作用或影响以及它们之间的接触和通讯。因此，本发明的巨型细胞外细胞器囊泡可用于研究生物化学反应，或用于疾病诊断，例如通过定义患病患者的疾病模式并将其与健康患者进行比较。34、本发明还涉及基于本发明的至少一种类型的巨型细胞外细胞器囊泡作为载体的用途，从而能够在产生用于药物递送应用的巨型细胞外细胞器囊泡之前包封或螯合目标分子，例如外源分子或由细胞表达的分子/蛋白质。