一种肿瘤微环境可激活的贻贝仿生介孔抗癌纳米

本发明属于纳米生物医用领域，具体涉及一种肿瘤微环境可激活的贻贝仿生介孔抗癌纳米试剂及其制备方法。背景技术：1、癌症(恶性肿瘤)是全世界导致死亡的主要原因之一，据调查显示2022年我国癌症新发病患者有406.4万例，占全球发病人数的20.6％，因癌症死亡人数更是高达241.4万人，占全球癌症死亡人数的28.2％，是仅次于心脏病的第二大死亡原因，给人类带来了巨大的痛苦和恐惧，因此治疗恶性肿瘤已成为全人类关心的重大问题。目前，临床治疗一般采用手术治疗、化疗(ct)、放射治疗(rt)等方式，但这些传统的治疗方式不能完全清除癌细胞，且对正常组织细胞有较大的损伤。本发明通过研究制备一种肿瘤微环境可激活的贻贝仿生介孔抗癌纳米试剂及其制备方法，在其硫化铜空腔内部负载功能性生物酶，使用贻贝仿生的配体聚合物包裹中空介孔硫化铜形成抗癌纳米试剂，该纳米粒子具有特异性主动靶向且在血液中可以长时间循环，同时会增强癌细胞摄取并从溶酶体逃逸，可以在体内同时进行光热治疗(ptt)、光动力治疗(pdt)、化学动力学治疗(cdt)、饥饿治疗(st)等多种治疗方法，在极小的毒副作用情况下达到优异的癌症治疗效果。总而言之，本发明设计的一种肿瘤微环境可激活的贻贝仿生介孔抗癌纳米试剂及其制备方法，因其具有主动靶向性、高选择性、毒副作用小等特点，避免对正常组织细胞有较大的损伤，可以在未来作为新兴癌症治疗方式替代传统治疗，为人类健康和癌症治疗贡献一份力量。2、中空介孔硫化铜作为优异的新型近红外响应型材料，在生物医学领域，特别是癌症治疗引起了广发的关注。因其特殊的物理性质，如有很强的局部表面等离子共振效应(lspr)，使其作为一种光热转换试剂，用于光热治疗(ptt)，还可以产生具有细胞毒性的活性氧(杀菌效果极好)。除此之外，硫化铜吸收近红外光(nir)会使生物组织膨胀，产生光声信号，可以作为一种光声造影剂，确定肿瘤所在位置/大小/形态等。因此硫化铜即可作为一种多功能的优良癌症治疗材料。技术实现思路1、本发明主要针对单一传统癌症治疗方法的缺陷，提供一种肿瘤微环境可激活的贻贝仿生介孔抗癌纳米试剂及其制备方法，该方法制备的中空介孔硫化铜纳米药物具有以下几种特点：2、生物安全性：聚合物中的透明质酸和聚乙二醇在生物体中可以长期存在，并对生物组织没有排斥损伤；3、特异靶向性：在多种癌细胞的细胞膜表面都有过表达的cd44可以与透明质酸ha特异性识别靶向；4、协同治疗高效性：通过光热治疗、光动力治疗、化学动力学治疗、饥饿治疗等多种方法协同治疗，实现治疗的高效性。5、为了实现以上要求，本发明提供了以下技术方案：一种肿瘤微环境可激活的贻贝仿生介孔抗癌纳米试剂及其制备方法步骤如下：6、(一)中空介孔硫化铜的制备方法：7、步骤1：在室温环境，取8～12mg二水合氯化铜(cucl2·2h2o)和300～500mg聚乙烯吡咯烷酮(pvp-k30，分子量为58000da)分散在去离子水中，在超声完全溶解后，搅拌5min，得到溶液a；溶液a中二水合氯化铜的浓度为0.1～0.3mg/ml，聚乙烯吡咯烷酮的浓度为8～12mg/ml；8、步骤2：向溶液a中加入ph＝9的氢氧化钠溶液30-80ml，搅拌5min得到溶液b，溶液b二水合氯化铜和氢氧化钠的体积比为1:300～500；9、步骤3：向溶液b中加入50％水合肼溶液30～40μl，搅拌5min，得到溶液c，溶液c二水合氯化铜和水合肼的体积比为1:0.1～0.3；10、步骤4：向溶液c中加入浓度为300～400mg/ml九水合硫化钠溶液300-500μl，将溶液转移到50～90℃的油浴中反应1～4小时，得到溶液d，溶液d中二水合氯化铜和九水合硫化钠的体积比为1:3～5；11、步骤5：溶液d冷却至室温后，离心(11000～13000rpm，10～15min下同)，洗涤(超纯水洗涤2～3次下同)，冷冻干燥30～40h后，得到固体e，即为中空介孔硫化铜纳米颗粒。12、(二)贻贝仿生配体聚合物的制备方法：13、步骤6：将0.8～1.2g透明质酸钠(分子量为8000～10000da)、0.3～0.6g的1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐(edc·hcl)和0.2～0.5g的n-羟基琥珀酰亚胺(nhs)分散在去离子水中，其中1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐与n-羟基琥珀酰亚胺的摩尔量相同，透明质酸钠和二者任一的摩尔比可以为1:20～40；在氮气氛围的25～35℃条件下反应90～150分钟。14、步骤7：将1～2g的单端为胺基的聚乙二醇单甲醚(mpeg-nh2)溶解去离子水中，加入到步骤6的15、产物中在25～35℃氮气保护下反应20～30h，得到聚乙二醇化的透明质酸(ha-mpeg)，混合溶液中透明质酸与聚乙二醇的摩尔比为1:2。16、步骤8：将步骤7的产物加入到含有5～10ml二乙烯三胺的双口瓶中，在25～35℃氮气保护下反应20～30h，得到接枝二乙烯三胺和聚乙二醇的透明质酸(ha-mpeg-deta)，混合溶液中透明质酸与二乙烯三胺的摩尔比为1:60～80；17、步骤9：将步骤8的产物置于截留分子量为7000～8000的透析膜中，用过量的去离子水透析纯化72h左右，透析后的溶液在-60～-40℃下冷冻干燥，得到由聚乙二醇和二乙烯三胺修饰的透明质酸(ha-mpeg-deta)固体，冷冻保存。18、步骤10：取(a)80～120mg硫辛酸与n'n-羰基二咪唑(cdi)、(b)100～150mg二氢卟吩e6与二环己基碳二亚胺(dcc)和n～羟基琥珀酰亚胺(nhs)，分别加入二甲基亚砜(dmso)混合均匀后，在氮气氛围的25～35℃下反应90～150分钟；(a)硫辛酸与n'n-羰基二咪唑(cdi)和(b)二氢卟吩e6与二环己基碳二亚胺(dcc)和n-羟基琥珀酰亚胺(nhs)的摩尔比均为1:1.1～2.2；19、步骤11：取0.8～1.2g步骤7所得固体ha-mpeg-deta溶解在15～30ml去离子水中，分别将步骤10所配制的两种混合溶液缓慢的加入到其中，在25～35℃氮气保护下反应20～30h，接枝二乙烯三胺和聚乙二醇的透明质酸(ha-mpeg-deta)与硫辛酸(la)和二氢卟吩e6(ce6)的摩尔比分别是1:6～10和1:3～5；20、步骤12：将步骤11的溶液置于截留分子量为3000～4000的透析膜中，用过量的去离子水透析纯化72h左右，透析后的溶液在-60～-40℃下冷冻干燥，得到由硫辛酸和二氢卟吩e6改性的接枝聚乙二醇和二乙烯三胺的透明质酸(ha-mpeg-deta(la-ce6))墨绿色固体载体聚合物，-20℃冷冻保存。21、本发明采用了上述制备方法得到的中空介孔硫化铜和配体聚合物用于合成一种肿瘤微环境可激活的贻贝仿生介孔抗癌纳米试剂，其具体的实施步骤为：22、步骤a：室温条件下，取10-20mg(一)中步骤5所得固体e，即中空介孔硫化铜溶解于15～30ml的去离子水中，超声分散30～60min；23、步骤b：向步骤a中加入10-20mg葡萄糖氧化酶(黑曲霉)，避光条件下超声1h，搅拌10～12h，离心(12000rpm，10min)，超纯水洗涤2～3次，在-60～-40℃下冷冻干燥，得到固体f，溶液中固体e与葡萄糖氧化酶(黑曲霉)的质量比为1:0.8～1.5；24、步骤c：取100-200mg(二)中步骤12中的载体聚合物(ha-mpeg-deta(la-ce6))与20-50mg硼氢化钠(nabh4)，加入10～30ml去离子水溶解，在25～35℃氮气保护下反应20～30h，利用硼氢化钠的强的还原性使硫辛酸中的二硫键断裂产生巯基衍生物；载体聚合物(ha-mpeg-deta(la-ce6))与硼氢化钠(nabh4)的质量比为1:0.2～0.4；25、步骤d：将10～20mg步骤b固体产物f分散在10～30ml去离子水中加入到步骤c的产物中，在25～35℃氮气保护下反应10～15h；其中固体产物f与载体聚合物的质量比为1:8～12；26、步骤e：将步骤d的溶液置于截留分子量为28000～40000的透析膜中，用过量的去离子水透析纯化72h左右，透析后的溶液在-60～-40℃下冷冻干燥25～40h得到固体产物g。墨绿色固体产物的产率可以达到70％～85％；27、具体的，本发明制备的一种肿瘤微环境可激活的贻贝仿生介孔抗癌纳米试剂，其合成步骤c中产生的巯基衍生物用于载体聚合物和中空介孔硫化铜进行螯合配位。28、本发明采用的上述方法得到的一种肿瘤微环境可激活的贻贝仿生介孔抗癌纳米试剂，可应用于癌症的光热治疗、光动力学治疗、化学动力学治疗、饥饿治疗等组合治疗。29、和现有技术相比，本发明一种肿瘤微环境可激活的贻贝仿生介孔抗癌纳米试剂具有如下优点：30、(1)以二水合氯化铜、聚乙烯吡咯烷酮(pvp-k30)、氢氧化钠、水合肼和九水合硫化钠为原料，制得的黑褐色固体为中空介孔硫化铜纳米颗粒；然后以透明质酸、聚乙二醇、二乙烯三胺、硫辛酸、二氢卟吩e6为原料合成的配体聚合物以及葡萄糖氧化酶(黑曲霉)制备的一种肿瘤微环境可激活的贻贝仿生介孔抗癌纳米试剂。本发明采用的原料毒性小，生物安全性高。31、(2)以透明质酸为主链骨架，可以有效的靶向具有cd44的受体的癌细胞，提高主动靶向性，定位更加精准，治疗更加高效。32、(3)配体聚合物中含有的聚乙二醇可以延长纳米药物在血液系统中的循环时间，减少血液对纳米药物的吸收。二乙烯三胺的仲胺基团能够质子化，使得细胞内的溶酶体破裂。33、(4)中空介孔硫化铜的制备原料成本低廉，制备过程易操作控制，反应条件较为温和。34、(5)本发明制备的中空介孔硫化铜尺寸在150～200nm，尺寸分布均一，本发明制备的纳米药物表面电荷为负电荷，负电荷有利于纳米药物在血液中的流动，不会被负电荷的红细胞吸引，形成血栓。35、(6)中空介孔硫化铜具有良好的近红外响应效果，可以达到光热治疗。以及释放的铜离子发生类芬顿反应所完成的化学动力学治疗，再协助配体聚合物中的光敏剂二氢卟吩e6通过特殊波长的激光激发，完成光动力学治疗，以及中空介孔硫化铜的空腔内部负载的葡萄糖氧化酶(黑曲霉)可以消耗肿瘤细胞内部的葡萄糖，阻断细胞代谢的能量供应，达到饥饿治疗的目的。多种治疗方式相互配合，相互协同，以达到更高效的治疗效果。36、(7)本发明中的硫化铜可以催化肿瘤细胞内过量的过氧化氢，产生更多的氧气助力光动力治疗和饥饿治疗，产生更多的单线态氧和过氧化氢，循环利用，可以提高治疗效率。