基于变构蛋白腺苷酸激酶的微观动态膜材料及其

本发明属于蛋白质膜材料，具体涉及基于变构蛋白腺苷酸激酶的微观动态膜材料及其制备方法。背景技术：1、生物体内的振荡现象对维持生命节律至关重要，模拟这种生物振荡行为可以实现化学能到机械能的周期性转换，这是实现体外组装类生命系统的必要前提。其中，心肌细胞的脉动是一个非常典型的例子。心肌细胞的细胞膜中含有大量的ca2+离子通道，这些通道能够结合外部ca2+并改变构象，导致ca2+的快速内流和细胞收缩。当细胞内ca2+水平超过阈值时，离子通道的构象发生逆转并排出ca2+，细胞松弛恢复初始状态。这种ca2+诱导的蛋白质构象转变是引起心肌细胞发生周期性脉动的化学基础。2、由于囊泡的结构与生物膜非常相似，受自然启发，最近的一些研究开始使用人造囊泡系统模拟这种细胞自我脉动行为。尽管取得了一些可观的进展，但组装系统需要与独立于组装的额外生物或化学振荡反应耦合。这将使系统变得复杂，并且不可避免地在其中产生不必要的化学废物，这将随着时间的推移减弱振荡并限制动态过程的时空可控性。技术实现思路1、本发明的目的在于提供一种基于变构蛋白腺苷酸激酶在微观尺度上实现动态组装的自振荡材料的制备方法和应用。2、针对现有技术中上述问题，本发明使用一种像心肌细胞中的通道蛋白一样本身具有自振能力的蛋白质，设计基于蛋白质的巨型两亲分子制备的蛋白质囊泡系统，该系统可以在不引入额外化学振荡的情况下自发脉动。本发明选用具有双向催化作用的变构蛋白，当该蛋白与底物结合时，触发蛋白质构象的转变，催化底物向产物的正向转化，直到底物耗尽。相反，当产物浓度较高时，蛋白可以通过同样的变构识别引发产物到底物的反向转化，并重置系统。在这个过程中，蛋白质囊泡会因蛋白质变构效应引起的亲疏水性的改变而发生周期往复的收缩和扩张。随着蛋白质囊泡的变形，膜的渗透性也会发生周期性地波动，利用这一特性可以实现载荷物的脉冲式释放，从而满足长期、自动、定时的纳米递送的需求场景，实现由蛋白质变构效应调控的类生命系统的微观动态膜材料。3、具体地，本发明采用一种常见的变构蛋白，腺苷酸激酶(ake)作为主要的蛋白质单元。ake具有双底物结合域(atplid和amplid)，当它同时与腺苷三磷酸(atp)和腺苷单磷酸(amp)结合时，可以闭合其构象。这种变构效应可以催化磷酸转移反应，即atp+amp→2adp。催化结束后，ake发生构象松弛并返回其初始开放状态。相反，当adp浓度水平较高时，ake也可以结合两个adp来促进逆向反应，生成atp和amp以供下一个循环使用。结合这种变构特性，本发明将一个单一的聚(l-亮氨酸)pl链作为疏水尾部连接到ake表面，构建一种蛋白质-聚肽超大分子，记为ake-pl。由于野生大肠杆菌ake表面仅存在一个半胱氨酸位点(cys77),因此可以通过巯基-马来酰亚胺迈克尔加成反应在该位点接上一条聚(l-亮氨酸)。这样的ake-pl超大分子可以在水溶液中自组装形成蛋白质囊泡，并在添加底物atp和amp时通过底物诱导的变构循环发生形状振荡，在微观尺度上实现动态组装的自振荡材料。4、本发明提供的基于变构蛋白腺苷酸激酶微观动态膜材料的制备方法，合成路线参见图1，具体步骤为：5、(1)将2～5g l-亮氨酸和2～6g双(三氯甲基)碳酸酯加入无水乙酸乙酯(50～100ml)中，蒸馏1～2g三甲胺30s后，在50～60℃下搅拌反应；5～10小时后，反应物完全溶解，将反应冷却至室温；以乙酸乙酯/己烷((3-6)/1，v/v)为原料，经两次重结晶，得到环状单体，记为nca-l-leu；6、(2)在干燥氩气的条件下，将10～30mg马来酰亚胺封端的nh2引发剂溶解在5～10ml无水dmf中；随后，将步骤(1)中制备的1～2g环状单体nca-l-leu加入反应烧瓶中，在80～90℃下反应48～72小时；将得到的混合物滴入过量的乙醚中并过滤；在真空条件下除去沉淀物中的残余溶剂；将所得聚合物在dmf中再溶解，用透析管(m.w.c.o.～1.0kda)在去离子水中透析48～72小时；经冷冻干燥，得到白色的马来酰亚胺封端的聚(l-亮氨酸)粉末；7、(3)将50～100mg野生型大肠杆菌ake蛋白与步骤(2)中制备的30～60mg马来酰亚胺封端的聚(l-亮氨酸)在10～20ml氮气净化的tris-hcl缓冲液中混合；将反应溶液在氮气气氛的保护下室温搅拌12～24小时；将产物溶解于0.1mm的nacl洗脱液中，经凝胶过滤柱纯化得到蛋白-多肽偶联物，记为ake-pl；8、(4)将步骤(3)得到的ake-pl溶于组装溶液，在室温中进行孵育2～4h；随后加入等量20～60μm的具有变构催化能力的双底物atp、adp；所述组装溶液为tris-hcl缓冲液与nacl的混合溶液。9、本发明提供的基于变构蛋白腺苷酸激酶的微观动态膜材料，是利用变构蛋白腺苷酸激酶的双重底物识别特性，将一个单一的聚(l-亮氨酸)pl链作为疏水尾部连接到亲水的蛋白表面，构建一种蛋白质-聚肽巨型两亲分子(ake-pl)，进而得到自振荡蛋白质囊泡系统。10、本发明制备的基于变构蛋白腺苷酸激酶的微观动态膜材料，可以通过对蛋白质囊泡的脉动行为进行程序化控制，有效地调节膜的门控模式，从而管理多种物质的跨膜运输。此外，将实际生产医疗进程中的多种药物包埋至本发明制备的可程序化控制蛋白质囊泡中，可以实现自主、按需、长时间地药物递送，在医疗领域具有良好的应用场景。技术特征：1.一种基于变构蛋白腺苷酸激酶微观动态膜材料的制备方法，其特征在于，具体步骤为：2.一种由权利要求1所述制备方法得到的基于变构蛋白腺苷酸激酶微观动态膜材料，是一种自振荡蛋白质囊泡系统；通过对蛋白质囊泡的脉动行为进行程序化控制，有效地调节膜的门控模式，从而管理多种物质的跨膜运输。3.如权利要求2所述基于变构蛋白腺苷酸激酶微观动态膜材料在制备医疗药物递送体系中的应用。技术总结本发明属于蛋白质膜材料技术领域，具体为基于变构蛋白腺苷酸激酶的微观动态膜材料及其制备方法。本发明采用腺苷酸激酶(AKe)作为主要蛋白质单元，利用腺苷酸激酶的双重底物识别特性，将单一的聚(L‑亮氨酸)PL链作为疏水尾部连接到亲水的蛋白表面，构建一种蛋白质‑聚肽巨型两亲分子(AKe‑PL)，具体为一种蛋白质囊泡系统，可以对其脉动行为进行程序化控制，有效地调节膜的门控模式，从而管理多种物质的跨膜运输。本发明可以将实际生产医疗进程中的多种药物包埋至蛋白质囊泡中，进而实现自主、按需、长时间地药物递送，在医疗领域具有良好的应用前景。技术研发人员：闫强,董程受保护的技术使用者：复旦大学技术研发日：技术公布日：2024/8/16