一种自演变双发射长余辉基纳米探针、构建方法

本发明涉及一种自演变双发射长余辉基纳米探针的制备及应用，属于先进功能材料和生物医药。背景技术：1、肿瘤细胞的转移是癌症致命性的主要原因之一，尤其是肺癌在全国范围内的死亡率最高。为提高肺癌患者的存活率，早期精准诊断和特异性治疗至关重要。长余辉纳米粒子(plnps)具有可再生的余辉特性，在活体水平低背景成像方面展现了巨大潜力。然而，传统的单波长发射plnps可能受到外部因素的影响，导致结果不准确。构建基于双发射plnps的比值磷光传感器可以实现自校准读数和低背景成像，有效避免干扰。因此，开发精准诊疗策略，实现肺癌精准成像和高效低毒治疗具有重要意义。2、当前研究中存在一些挑战，如传感器在病变组织和正常组织具有恒定的磷光比值信号，以及纳米材料在非靶向聚集时可能产生假阳性信号，如肺等内皮网状系统中。因此，迫切需要开发肿瘤微环境响应型磷光比值纳米探针，以实现对肺癌的精确成像。3、在诊断信息的指导下实现精确治疗具有实用价值。按需激活疗法提供了一种前景广阔的选择，即治疗剂的细胞毒性仅在病变部位特异性开启。化学动力疗法(cdt)是一种新兴的癌症治疗方法，具有高选择性、微创性和副作用小等特点。cdt依靠芬顿或类芬顿反应将h2o2分解为有细胞毒性的·oh，破坏细胞的氧化还原平衡，从而抑制肿瘤细胞生长及转移。肿瘤tme中的弱酸性和过度表达的h2o2可作为cdt的内源激活试剂，为按需治疗提供了可能。然而，tme中的gsh会影响cdt的效率，引入gsh消耗机制可以改善cdt的效果。将按需激活与增强cdt特性整合到同一纳米诊疗探针中，有望在精确成像的同时实现高效低毒治疗。技术实现思路1、[技术问题]大多荧光分析法需要激发光长时间照射，复杂样品基质的自荧光干扰无法避免，准确度低。常用长余辉基探针大多基于单一发光信号，监测结果易受仪器因素、检测时间窗和探针浓度等因素的影响，从而产生误差。此外，肿瘤部位过表达的gsh维持肿瘤微环境中的氧化还原稳态，会影响cdt效率，严重影响其在生物体内的成像和治疗效果。2、为了解决上述问题，本发明提供了一种具有良好537nm发射磷光和增强型cdt潜能的长余辉纳米粒子制备方法，和一种在537nm和700nm具有双波长发射的长余辉基纳米材料的构建方法，并将其用于肺转移瘤的无自发荧光比率成像和按需增强型cdt。本发明构建的纳米探针具有稳定性好、无样品自身荧光干扰、不受外界条件干扰、治疗性能按需释放和增强型肿瘤抑制效果等优点，在肺转移瘤的成像与治疗方面有广阔前景。3、本发明的第一个目的是提供一种自演变双发射长余辉基纳米探针的制备方法，包括如下步骤s1和s2：4、s1、长余辉纳米粒子zgmc的制备及表面巯基的修饰；5、s2、双发射长余辉基纳米探针zgmc@zgc-tat的构建；6、所述步骤s1包括步骤s11和s12，7、s11、纳米粒子的制备：将zn2+盐、mn2+盐和cu2+盐溶于水并混合均匀后加入浓酸和ge(ⅳ)溶液，然后加入ctab，调节ph后，转移到反应釜中加热，反应结束后，离心洗涤得到zgmc长余辉纳米粒子；8、s12、纳米粒子的巯基功能化：将步骤s11制得的zgmc粉末超声分散于碱液中，搅拌，反应结束后，离心洗涤干燥后，分散在有机溶剂中，逐滴加入巯丙基三乙氧基硅烷试剂(mptes)，加热回流搅拌，反应结束后，洗涤干燥，得到固体粉末zgmc-sh；9、步骤s2包括，s21：超小长余辉纳米粒子zgc的制备；s22：超小长余辉纳米粒子zgc的马来酰亚胺基团修饰；s23：磁性纳米粒子mnps的制备及巯基功能化；10、和s24：双发射长余辉基纳米探针的制备：将步骤s1制得的zgmc-sh与步骤s22制得的马来酰亚胺基团修饰的zgc分散于pbs中，搅拌后加入步骤s23制得的mnps-sh；将产物与穿膜肽tat混合于pbs中搅拌反应，得到双发射长余辉基纳米探针zgmc@zgc-tat。11、在本发明的一种实施方式中，步骤s11中所述浓酸为浓hno3；12、在本发明的一种实施方式中，步骤s12中所述有机溶剂为n,n-二甲基甲酰胺。13、本发明的第二个目的是一种具有537nm磷光发射和增强型cdt潜能的长余辉纳米粒子的制备方式，具体包括前文所述步骤s11。14、在本发明的一种实施方式中，步骤s11在聚四氟乙烯内衬的不锈钢水热反应釜中进行水热反应；15、在本发明的一种实施方式中，步骤s11反应结束后，冷却，离心收集沉淀，洗涤，干燥，研磨，得到长余辉纳米材料zgmc。16、进一步地，步骤s11中，所述的ge(ⅳ)和cu2+盐的摩尔比为1:(0.001-0.005)。17、在一些优选的实施方式中，步骤s11中，所述的zn2+盐、ge(ⅳ)、mn2+盐和cu2+盐的摩尔比为2:1:0.005:(0.001-0.005)。18、进一步地，步骤s11中，所述的ge(ⅳ)和ctab比例为1nmol:(10-20)mg；19、在一些优选的实施方式中，步骤s11中，所述ge(ⅳ)、浓hno3和ctab比例为1nmol:300μl:(10-20)mg；20、进一步地，步骤s11中，调节ph步骤，ph应调节至8.0-10.0；21、在一种实施方式中，步骤s11中，使用氨水调节ph；22、进一步地，步骤s12所述碱溶液选自naoh、koh溶液；23、在一种实施方式中，步骤s12中碱溶液为naoh溶液，浓度为4-6mmol l-1；24、进一步地，步骤s12中n,n-二甲基甲酰胺溶液与mptes的体积比为1:(0.002-0.010)；25、在本发明的一种实施方式中，步骤s12中加热回流反应的条件为(60-100)℃。26、在本发明的一种实施方式中，步骤s1中，锌盐、ge(ⅳ)、锰盐、铜盐的摩尔比为2:1:0.005:0.002。27、在本发明的一种实施方式中，步骤s11中，锌盐具体可选zn(no3)2；28、在本发明的一种实施方式中，步骤s11中，锰盐具体可选mn(no3)2；29、在本发明的一种实施方式中，步骤s11中，铜盐具体可选cu(no3)2；30、在本发明的一种实施方式中，步骤s11中，ge(ⅳ)和hno3比例为1nmol:300μl:31、在本发明的一种实施方式中，步骤s11中，水热反应的条件是220℃反应6h。32、在一种优选的实施方式中，步骤s1中，碱溶液相对长余辉纳米材料zgmc的用量条件为1ml:1mg。33、在一种优选的实施方式中，步骤s1中，n,n-二甲基甲酰胺相对长余辉纳米材料zgm的用量条件为2ml:1mg。34、在一种优选的实施方式中，步骤s1中，n,n-二甲基甲酰胺溶液与mptes试剂的体积比为1:0.008。35、在一种优选的实施方式中，步骤s12、长余辉纳米粒子zgmc的巯基功能化：将zgmc粉末超声分散于naoh溶液中，室温下剧烈搅拌，反应结束后，离心洗涤，干燥，将其分散在n,n-二甲基甲酰胺溶液中，逐滴加入巯丙基三乙氧基硅烷试剂(mptes)，加热回流搅拌，反应结束后，离心洗涤，真空干燥，得到固体粉末zgmc-sh；36、在一种优选的实施方式中，步骤s1中，加热回流反应的条件为80℃下持续24h。37、进一步地，所述步骤s2包括s21、s22、s23、s24：38、s21、超小长余辉纳米粒子zgc的制备：将锌盐、镓盐溶解于有机溶剂中，加热搅拌，加入铬盐和无水甲醇，随后转移到水热反应釜中发生溶剂热反应，离心洗涤干燥，得到超小长余辉纳米材料zgc；39、s22、超小长余辉纳米粒子zgc的马来酰亚胺基团修饰：将步骤s21制得的zgc粉末与dspe-peg2000-mal分散于三氯甲烷溶液中，加热搅拌反应后加入超纯水，旋蒸除去三氯甲烷，离心收集固体粉末，干燥后得到固体粉末zgc-mal；40、s23、磁性纳米粒子mnps的制备及巯基功能化：将fecl3·6h2o、na3cit2·h2o和ch3co2na混合于乙二醇后，在一定温度下搅拌，将混合物转移到高压反应釜中进行加热反应，固液分离，洗涤并干燥后得到mnps；将mnps分散于乙醇中，依次加入超纯水、氨水、硅酸乙酯和乙醇，反应后洗涤沉淀，再将沉淀分散于异丙醇中，加入mptes，反应后，洗涤沉淀，得到mnps-sh；41、s24、双发射长余辉基纳米探针的制备：将步骤s1制得的zgmc-sh与步骤s22制得的zgc-mal分散于pbs中，搅拌后加入步骤s23制得的mnps-sh，反应后磁分离，洗涤干燥；将产物与穿膜肽tat混合于pbs中搅拌反应，洗涤、干燥后得到双发射长余辉基纳米探针zgmc@zgc-tat。42、在本发明的一种实施方式中，步骤s21在聚四氟乙烯内衬的不锈钢水热反应釜中进行反应；43、在本发明的一种实施方式中，步骤s22中的干燥方法采用冷冻干燥；44、进一步地，步骤s21中所述的有机试剂可选十八烯和油酸，体积比为5:4。45、进一步地，步骤s21中，锌盐具体可选zn(acac)2或其水合物。46、进一步地，步骤s21中，镓盐具体可选ga(acac)3或其水合物。47、进一步地，步骤s21中，铬盐具体可选cr(acac)3或其水合物。48、在本发明的一种实施方式中，所述锌盐为zn(acac)2，镓盐为ga(acac)3，铬盐为cr(acac)3；49、在本发明的一种实施方式中，步骤s21中，锌盐、镓盐、铬盐的摩尔比为1:2:0.004。50、在本发明的一种实施方式中，步骤s21中，溶剂热反应的条件为200-300℃反应24h。51、进一步地，步骤s22中，zgc粉末、dspe-peg2000-mal的质量比为1:(0.5-1.5)。52、进一步地，步骤s22中，zgc粉末、三氯甲烷的比例为(2-4)mg:1ml。53、在本发明的一种实施方式中，步骤s22中，zgc粉末、三氯甲烷的比例为4mg:1ml。54、在本发明的一种实施方式中，步骤s22中，加热反应条件可选50-60℃。55、进一步地，步骤s23中，fecl3·6h2o、na3cit2·h2o和ch3co2na的质量比为5.4:1:8；56、进一步地，步骤s23中，fecl3·6h2o和乙二醇的比例为1mg:24.69ml；57、进一步地，步骤s23中，加热搅拌的条件为40-80℃；58、在一种优选的实施方式中，步骤s23、磁性纳米粒子mnps的制备及巯基功能化：将fecl3·6h2o、na3cit2·h2o和ch3co2na混合于乙二醇后，在一定温度下搅拌，将混合物转移于聚四氟乙烯衬底的高压反应釜中进行加热反应。离心洗涤并干燥后得到mnps。将mnps分散于乙醇中，依次加入超纯水、氨水、硅酸乙酯和乙醇，机械搅拌9h后，洗涤沉淀，再将沉淀分散于异丙醇中，加入mptes，机械搅拌9h后，洗涤沉淀，得到mnps-sh；59、在本发明的一种实施方式中，步骤s23中，加热搅拌的条件为50℃。60、进一步地，步骤s23中，mnps和乙醇的比例为1.5mg:1ml；61、进一步地，步骤s23中，乙醇、超纯水、氨水和硅酸乙酯的体积比为100:25:1.2:0.1:5；62、进一步地，步骤s23中，异丙醇和mptes的体积比为120:0.5。63、在本发明的一种实施方式中，步骤s23中，水热反应的条件为200℃反应12-24h。64、进一步地，步骤s24中，所述的zgmc-sh和zgc-mal的质量比为1:(2-10)；65、在本发明的一种实施方式中，步骤s24中，zgmc-sh和zgc-mal的质量比为1:(3-8)。66、进一步地，步骤s24中，mnps-sh与zgc-mal的质量比为1:(2-4)；67、进一步地，步骤s24中，加入tat与产物的质量比为(0.5-1.5):1。68、在本发明的一种实施方式中，步骤s24中，所用pbs的ph值为7-10。69、在本发明的一种实施方式中，离心的转速为8000-12000rpm；洗涤沉淀的时间为5-15min。70、本发明的第三个目的在于提供本发明所述的方法制备得到的具有绿光发射和增强型cdt潜能的长余辉纳米粒子zgmc。71、进一步地，制得的长余辉纳米粒子zgmc，具有537nm处的磷光发射，且能够消耗肿瘤微环境中过表达的gsh。72、本发明的第四个目的在于提供前文所述制备方法制得的自演变双发射长余辉基纳米探针，所述双发射长余辉基纳米探针为基于肿瘤微环境响应型磷光比值纳米探针。73、本发明的第五个目的在于提供前文所述自演变双发射长余辉基纳米探针的应用，应用于制备生物成像和治疗产品；进一步地，应用于肺转移性肿瘤比率成像或应用于按需治疗产品中；74、进一步地，应用于制备肿瘤、细菌感染和炎症的诊断与治疗产品。75、本发明的第六个目的在于提供一种生物成像制剂，含有前文所述的自演变双发射长余辉基纳米探针。76、本发明的再一个目的是提供一种用于活细胞成像或肿瘤活体成像诊断方法，所述方法是采用本发明所述双发射长余辉基纳米探针zgmc@zgc-tat，所述细胞具体可以包括小鼠鳞状细胞癌细胞scc-7和小鼠乳腺癌细胞4t1。77、本发明的再一个目的是提供一种用于肿瘤细胞杀灭或肿瘤按需治疗手段，所述方法是利用上述双发射长余辉基纳米探针，所述细胞具体可以包括小鼠鳞状细胞癌细胞scc-7和小鼠乳腺癌细胞4t1。78、有益效果：79、(1)本发明制备的长余辉纳米粒子zgmc，具有537nm处的磷光发射，通过掺杂mn2+和cu2+，消耗肿瘤微环境中过表达的gsh，增强化学动力治疗效果。80、(2)本发明制备的双发射长余辉基纳米探针zgmc@zgc-tat。具有537nm和700nm处的双发射信号，能够有效避免外界因素和探针浓度等因素的影响，得到自校准的磷光信号，且在肿瘤微环境刺激下表现出响应性的磷光信号，即537nm处磷光降低，700nm磷光不变，实现了区别于正常生理组织的磷光比值i700/i537。探针易聚集于肺组织，从而辨别肺部的正常和病变组织，实现细胞和活体层面的无背景荧光、肿瘤特异性成像。81、(3)本发明制备的双发射长余辉基纳米探针zgmc@zgc-tat在肿瘤环境下部分降解，带来了形貌的改变和尺寸的可控变化，使得探针兼顾大尺寸探针特有的肿瘤组织非特异性靶向性质，又提升了在肿瘤细胞中的深度穿透，确保其能在病变部位深度渗透和长效滞留，又能实现快速代谢。82、(4)本发明制备的双发射长余辉基纳米探针zgmc@zgc-tat在肿瘤微环境下释放cdt试剂，开启gsh消耗机制，可以增强·oh的生成，实现增强型化学动力治疗的效果。83、(5)该方法具有极强的可扩展性，为肺癌按需治疗的精确成像提供了一个新的视角，并对体内响应性探针的发展产生了积极影响。