一种含有MARCH1蛋白的抑制剂

本发明属于生物医药领域和病毒感染领域，具体涉及一种限制病毒介导的细胞-细胞融合的抑制剂。背景技术：1、伪狂犬病(pseudorabies，pr)是由伪狂犬病病毒(pseudorabies virus，prv)引起的传染性疾病。伪狂犬病病毒(prv)是一种重要的猪病毒，会给养猪业造成严重的经济损失。prv是一种双链dna病毒，属于疱疹病毒科，经常被用作疱疹病毒生物学研究的模型，因为它可以感染多种哺乳动物，甚至可能对人类安全构成威胁。伪狂犬病病毒的主要天然宿主和传染源是猪，但是许多野生动物包括野猪、熊、反刍动物(例如牛、山羊和绵羊等)、啮齿动物、食肉动物等也容易被prv感染，导致prv在自然界传播广泛且复杂，因此加大了伪狂犬病的防疫难度，给养猪业造成了巨大损失。数据表明，prv是一种新出现的人畜共患病原体，有可能在特定条件下感染人类。因此，研究人类prv感染过程及其宿主细胞的免疫反应对于控制人类prv的感染非常重要。2、成熟的prv病毒粒子即感染性病毒粒子类似于该家族的其他成员，在电镜下prv的病毒粒子为一个球形，直径为200～250nm；prv病毒体从内到外分别由病毒核心双链线状dna和(核心蛋白)衣壳、被膜和囊膜四个结构组成。162个帽状体组成的二十面体被嵌入一个称为被膜的蛋白质基质中，一起形成了被蛋白质皮层包围的核衣壳，prv的双链dna基因组位于这个具有保护性的核衣壳中。病毒最外层是病毒囊膜，病毒囊膜由来自宿主细胞的反式高尔基体构成的类脂双层结构形成，囊膜表面有许多纤突，长8～10nm，呈放射排列，是病毒特异性的被膜糖蛋白。prv基因组一共有72个开放阅读框(open reading frame，orf)和3个复制起点，主要用于编码病毒的与病毒复制释放相关的蛋白、与核酸代谢、转录调节因子、结构蛋白、毒力因子、dna合成以及蛋白质加工相关的酶，可编码近100种蛋白质，而成熟的病毒粒子结构中有50多种蛋白质。prv基因组中参与病毒组成的结构蛋白包含6种核衣壳蛋白(ul6、ul38、ul35、ul25、ul18、ul19)，15种膜蛋白(gb、gh、gc、gl、gk、gd、ge、gg、gl、gm和gn、ul20、ul43、us9和ul24)，14种基质蛋白(ul11、ul21、ul13、ul16、ul41、ul37、ul36、ul49、ul46、ul47、ul48、ul51、us3、us2)[63。病毒的非结构蛋白包括ul54、ul52、ul50、ul29、ul30.ul33、ul39、ul40、ul42、ul23、ul9、ul8、ul5、ul3.5、ul2和ie180。prv囊膜蛋白主要定位于病毒粒子的囊膜上，在病毒侵入、病毒在细胞与细胞之间传播以及释放等阶段都发挥着重要的作用，同时参与调控机体的免疫反应和促进合胞体的形成。prv基因组能编码16种囊膜蛋白，被n-或0-糖链修饰的蛋白有ge(us8)、gb(ul27)、l(ul1)、gi(us7).gc(ul44)、gn(ul49.5)、gk(ul53)、gg(us4)、gm(ul10)、h(ul22)、gd(us6)等11种蛋白；ul43、ul24、ul20和us9等4个蛋白是未经糖基化修饰的跨膜蛋白；ul34蛋白存在于早期的病毒囊膜中，是一种i型囊膜蛋白，在具有感染性的成熟病毒中没有发现该蛋白，推测ul34蛋白是非结构蛋白。这些蛋白在病毒复制增殖中又分为必需和非必需两类，在细胞内复制生长增殖过程中非必需的糖蛋白有gn、gl、gm、gc、ge和gg等，必需的糖蛋白有gh、gb、gd、gk和glis689。在病毒侵入过程中，prv囊膜的糖蛋白gb、gc、gh和gl参与病毒粒子吸附到宿主细胞表面的过程，并介导病毒囊膜与细胞膜的融合。由于糖蛋白位于病毒粒子的表面，因此prv的糖蛋白gc、gb、gd等是宿主免疫防御的优势靶标。3、膜相关环状蛋白ring—ch(membrane–associated ring-ch，march)家族是近年发现的一类属于e3泛素连接酶的环指结构域家族，迄今已发现的march家族成员有11种，分别是march1-11。march家族的成员分布广泛，参与多种细胞功能，如免疫调节，蛋白质量控制和膜转运，内质网相关降解，内体蛋白质运输，线粒体动力学平衡和精子发生调控等。膜相关环状蛋白1(membrane-associated ring-ch protein 1，march1)是属于march家族一员的e3泛素连接酶。march1含有一个ring-ch型锌指蛋白结构和一个tm结构域，主要表达于淋巴结、脾脏等免疫器官的抗原递呈细胞，如树突细胞(dendritic cells,dcs)。研究发现，march1蛋白分子上的tm结构域可以通过靶向结合人主要组织复合体ii类分子(mhcii)，并介导后者泛素蛋白酶降解。另外，cd86作为march1的e3连接酶特异性底物，可以被march1泛素化降解。缺乏mhcii、cd86的未成熟树突细胞，无法完成抗原抗体递呈。白介素10诱导的march1调控mhcii类分子的功能隔离也可以破坏dcs功能。而cd83分子可通对抗march1介导的cd86和mhcii类分子的降解，促进树突细胞向成熟型分化。先前大多数研究者主要关注在march1在免疫系统中的调节作用。而最近一项研究者发现，march1在卵巢癌组织高表达，沉默march1的表达可以通过下调nf-kb和wnt/p-catenin信号通路来抑制卵巢癌细胞的增殖、迁移和侵袭。这些表明march1可能是一种促癌基因，可能是癌症治疗的潜在分子靶点。还有研究表明，march1在肝细胞癌中存在异常高表达，高表达的march1对肝细胞癌具有强大的促癌功能，即march1可以通过调节pi3k/akt/bcatenin信号通路促进肝癌细胞的增殖迁移、侵袭，抑制其凋亡。4、最近，march1被证明具有抑制hiv-1感染的能力。然而，march1抗病毒活性仅在hiv-1上进行了测试；对它们在其他病毒中的作用知之甚少，尤其是疱疹病毒。因此，march1在疱疹病毒复制中的作用值得探讨。技术实现思路1、在目前的研究中，本发明评估了march1对prv复制的影响。我们发现march1能够有效抑制prv复制，即，march1在细胞间融合时(这是prv传播的关键步骤)限制了prv的复制；同时还发现march1能够阻断furin对gb的切割，但这种活性与march1对在体外的抗病毒活性没有相关性。在此基础上，完成了本发明。2、第一方面，本发明提供一种由伪狂犬病毒介导的细胞-细胞融合的抑制剂，所述抑制剂含有march1蛋白。3、进一步的，所述march1蛋白包括其衍生物、分离的核酸分子、含有march1蛋白的载体或宿主细胞和/或融合物。4、进一步的，所述march1蛋白可以是体内合成或人工合成的蛋白。5、进一步的，所述抑制剂可以通过抑制伪狂犬病毒中gb、gd、gh和gl蛋白的转移而抑制伪狂犬病病毒的复制。6、进一步的，所述伪狂犬病毒中gb、gd、gh和gl蛋白的转移是指march1将诱导细胞间融合的病毒蛋白复合体捕获在反式高尔基体网络(tgn)中。7、第二方面，本发明提供一种march1蛋白在制备治疗伪狂犬病毒感染引起的疾病中的应用。8、进一步的，所述应用是march1蛋白可抑制伪狂犬病病毒细胞与宿主细胞间的细胞融合。9、在一种实施方式中，所述应用是march1蛋白抑制伪狂犬病毒中gb、gd、gh和gl蛋白的转移或扩散而抑制伪狂犬病毒对宿主细胞的感染。10、第三方面，本发明提供一种促进剂在制备治疗伪狂犬病毒感染引起的疾病中的应用，其中所述促进剂为促进march1蛋白表达的活性成分。11、进一步的，所述活性成分可以是生物、化学或天然获得的活性成分。12、第四方面，本发明提供一种抑制伪狂犬病毒感染的方法，所述方法为将伪狂犬病毒中gb、gd、gh和gl蛋白进行突变、修饰或相互作用而限制其转移扩散。13、在一种实施方式中，所述方法为将march1蛋白与gb、gd、gh和gl蛋白相互作用，限制gb、gd、gh和gl蛋白在细胞内的转移。14、第五方面，本发明提供一种体外抑制伪狂犬病毒感染的方法，所述方法为将细胞与抑制dna病毒复制的抑制剂体外进行接触，所述抑制剂为march1蛋白。15、有益效果：16、本研究发现march1在细胞间融合阶段显著抑制prv的复制，进一步研究表明，march1与弗林蛋白酶相互作用，阻断了gb的切割，但是，这种活性对其体外抗病毒活性没有相关性。最终，本发明发现march1将诱导细胞间融合的病毒蛋白复合体捕获在反式高尔基体网络(tgn)中，证明march1具有抗prv感染活性。