基于主客体分子合成的近红外二区发光金纳米材

本发明属于功能纳米材料领域，具体涉及基于主客体分子合成的近红外二区发光金纳米材料及其应用。背景技术：1、肿瘤的治疗主要包括手术切除、放射治疗、化学治疗、光热疗法、光动力疗法和基因疗法等。在肿瘤的化学治疗中，无机纳米材料作为药物递送的纳米载体具有天然的优势，如提高药物的稳定性、生物利用效率和实现靶向输送等。然而，由于大尺寸(5-200nm)的纳米材料在体内循环过程中容易在网状内皮系统(如肝脏、脾脏)发生富集，这可能导致大尺寸的无机纳米材料无法及时通过肾脏排出体外，从而存在潜在的长期毒性。目前，大多数研究都片面地关注无机纳米材料用于癌症治疗中的治疗功效，而往往忽视了它们是否能从体内清除——这也是纳米载药体系能否获得临床转化的一个关键因素。因此，使用可肾清除的功能性纳米粒子已成为提高肿瘤治疗疗效和保障其生物安全性的主要策略。超小尺寸的发光金纳米粒子(aunps，d＜3nm)作为一类新型纳米材料，具有可见至近红外二区连续可调的光学性质、易表面功能化修饰以及良好的生物相容性，它在光学检测，生物传感，荧光示踪成像以及肿瘤治疗等领域备受关注。虽然，超小尺寸的金纳米材料相对于大尺寸的无机纳米粒子具有许多独特的优势而被广泛应用，但它仍存在肿瘤靶向效率低，肿瘤细胞中滞留时间短等缺陷，并且基于超小金纳米粒子载药的这种单一治疗策略往往很难治愈癌症，容易导致肿瘤的转移和复发。因此，开发集多种治疗模式为一体的肾清除型发光金纳米材料，增强其肿瘤靶向效率的同时，提高其在肿瘤细胞内的滞留时间，并将两种或多种治疗方式联合使用，这对提高肿瘤的治愈率和减小治疗副作用具有十分重要的意义。技术实现思路1、为了克服现有技术的缺点和不足，本发明提供了两种双配体修饰的近红外二区发光的金纳米粒子及其组装体在肿瘤成像与治疗中的应用。本发明提供的第一种超小金纳米粒子是由巯基修饰的主体分子环糊精(sh-cd)和环状多肽(c(rgdfc))所制备的近红外二区发光的aunps(cd/c(rgdfc)-aunps)，其具有高的肿瘤靶向能力和与客体分子强的主客体结合性能。本发明提供的第二种超小金纳米粒是由巯基聚乙二醇修饰的客体分子金刚烷(sh-peg-ada)和巯基丙酰肼(sh-mh)所制备得到的发光ada/mhaunps，再通过酰胺反应将化疗药物阿霉素(dox)修饰在发光aunps上得到具有近红外二区发光的超小aunps(ada/dox-aunps)。cd/c(rgdfc)-aunps表面的环状多肽c(rgdfc)可以增强超小aunps主动靶向肿瘤的能力，其表面的主体分子cd可以与ada/dox-aunps表面的客体分子ada通过主客体相互作用形成组装体，不仅可以增强金纳米组装体在细胞内的滞留时间，它还可以克服单个aunps较低的光热转换效率，赋予纳米组装体高效的光热治疗功能。此外，ada/dox-aunps在微酸(ph小于6.5)环境下可断键释放dox药物，诱导肿瘤细胞凋亡，从而可用于肿瘤细胞的化学治疗。因此，本发明制备的两种双配体修饰的近红外二区发光的金纳米粒子及其组装体在临床肿瘤成像和治疗领域具有较大的应用前景。2、本发明的目的通过以下技术方案实现：3、两种双配体修饰的近红外二区发光的金纳米粒子及组装体的制备及表征，包括以下步骤：4、(1)将巯基配体sh-cd和环状多肽c(rgdfc)、氯金酸、溶剂充分搅拌混合；5、(2)将巯基配体sh-peg-ada和sh-mh、氯金酸、溶剂充分搅拌混合；6、(3)分别向(1)和(2)的混合液中加入还原剂后，继续搅拌反应并维持反应液呈碱性；7、(4)反应完成后，透析纯化去除多余的小分子，离心除去大颗粒，得到近红外二区发光的cd/c(rgdfc)-aunps和ada/mh-aunps；8、(5)将小分子抗肿瘤药物dox与上述(4)中制备的ada/mh-aunps，通过酰胺化反应制备ada/dox-aunps，透析去除游离的dox，得到纯化的近红外二区发光ada/dox-aunps，在4℃条件下保存备用。其次，将步骤(2)中sh-peg-ada配体替换成sh-peg，其他步骤与ada/dox-aunps的制备过程一致，可制备得到近红外二区发光的peg/dox-aunps，作为实验对照组。9、优选地，步骤(1)和(2)中，所述溶剂为：去离子水、甲醇、乙醇、甲苯中的一种；所述混合的时间为10-30min。10、优选地，步骤(1)中，所述氯金酸与巯基配体物质的量之比为1：0.5～1：10。11、进一步优选的，步骤(1)中，所述巯基配体sh-cd和c(rgdfc)的物质的量之比1：0～0.1：1。12、优选地，步骤(2)中，所述氯金酸与巯基配体物质的量之比为1：0.5～1：10。13、进一步优选的，步骤(2)中，所述巯基配体sh-peg-ada和sh-mh的物质的量之比1：0～0.1：1。14、优选地，步骤(3)中，所述还原剂为硼氢化钠。15、进一步优选的，步骤(3)中，所述ph调节溶剂为naoh溶液。16、优选地，步骤(3)中，所述加入还原剂搅拌反应并使反应液维持ph为6～10。17、优选地，步骤(3)中，所述氯金酸与还原剂摩尔比为1：1～1：10。18、优选地，步骤(4)中，所述透析使用的透析袋的截留量为3500-14000da，透析时间为1～4天。19、优选地，步骤(4)中，所述纯化过程使用的超滤管截留量为10000～30000da。20、优选地，步骤(5)中，所述酰胺反应中ada/mh-aunps与dox的物质的量比为：1：500～1：5000。21、优选地，步骤(5)中，所述透析使用的透析袋的截留量为3500-14000da，透析时间为1～4天。22、优选地，步骤(5)中，所述纯化过程使用的超滤管截留量为10000～30000da。23、优选地，步骤(5)中，所述ada/dox-aunps的对照组为peg/dox-aunps，以上所合成的超小aunps粒径均一，其尺寸分布在1.1～2.2nm。24、进一步地：步骤(4)和(5)中，所述利用荧光光谱和紫外吸收光谱表征以上制备的近红外二区发光金纳米粒子。25、进一步地：通过傅里叶红外光谱(ftir)对步骤(4)和(5)所述近红外二区发光金纳米粒子表面配体的官能团进行表征。26、进一步地：通过透射电子显微镜(tem)对步骤(4)和(5)中所述近红外二区发光金纳米粒子进行表征，并统计金纳米粒子的粒径。其次，通过tem对cd/c(rgdfc)-aunps和ada/dox-aunps基于主客体相互作用所形成的纳米组装体进行表征，并统计组装体的尺寸。27、进一步地：通过对步骤(4)和(5)中所述发光金纳米粒子及其组装体的体外光热效率进行测试，光照时间为：10～30min,光照强度为：0.5～3w/cm2。28、本发明提供的两种双配体修饰的近红外二区发光金纳米粒子及组装体具有近红外二区发光的性能，可用于肿瘤的荧光成像分析；而且本发明提供的近红外二区发光cd/c(rgdfc)-aunps具有肿瘤主动靶向能力，其表面富含有主体分子cd，可以与修饰有客体分子ada的超小ada/dox-aunps通过主客体相互作用形成组装体，增强金纳米组装体在肿瘤细胞内的滞留量，并且将低光热效率的单分散小金纳米粒子转变成具有高效光热转化效率的组装体。此外，由于ada/dox-aunps表面修饰有可在微酸环境下断键释放的化疗药物dox，诱导细胞凋亡，从而构建集多种治疗方式于一体的肾清除纳米载药体系，实现肿瘤的化疗与光热等联合治疗，其在临床肿瘤成像和治疗领域具有较大的应用前景。29、进一步地：选用小鼠乳腺癌细胞(4t1)，探究步骤(4)和(5)中所述近红外二区发光金纳米粒子及组装体在不同浓度下的细胞光照毒性。30、进一步地：选用4-6周龄的balb/c雌性小鼠，构建4t1皮下瘤模型，将步骤(4)中所述近红外二区发光cd/c(rgdfc)-aunps通过尾静脉注射至小鼠体内，注射一定时间后，将步骤(5)中ada/dox-aunps和peg/dox-aunps分别通过尾静脉注射至小鼠体内。对以上小鼠分成两组，其中一组利用二区活体成像仪对小鼠进行肿瘤靶向荧光成像分析。而另一组用红外热像仪对小鼠肿瘤部位进行热成像分析。31、优选地，将步骤(4)中近红外二区发光cd/c(rgdfc)-aunps通过尾静脉注射至小鼠体内，注射体积200-400μl，浓度0.5-2μm。32、进一步地，将步骤(5)中近红外二区发光ada/dox-aunps和peg/dox-aunps分别通过尾静脉注射至小鼠体内，注射体积200-400μl，浓度0.5-2μm。33、进一步地，所述二区活体成像仪对小鼠进行肿瘤靶向荧光成像分析。成像条件：激发波长808nm，曝光时间0.1-0.5s。34、进一步地，所述红外热像仪对小鼠肿瘤进行热成像分析，光照时间：5-60min，光照强度为：0.1～2w/cm2。35、进一步地，选用4-6周龄的balb/c雌性小鼠，构建4t1皮下瘤模型，分别于建模后的第5、7、9天尾静脉注射步骤(4)所制备cd/c(rgdfc)-aunps，注射体积200-400μl，浓度0.5-2μm注射两小时后，再注射ada/dox-aunps，注射体积200-400μl，0.5-2μm。尾静脉注射第二种纳米材料24小时后，用激光照射肿瘤部位，在治疗过程中监测小鼠肿瘤生长情况，体重变化(从注射第一针纳米制剂开始)，最后，对小鼠实施安乐死，取肿瘤组织和各主要器官进行拍照和he病理分析。36、优选地，所述肿瘤治疗过程选用808nm或者1064nm激光器,光照时间：5-20min，光照强度：0.1～2w/cm2。37、进一步地，通过游标卡尺和电子天平记录肿瘤大小和小鼠体重。38、与现有技术相比，本发明具有如下优点和技术效果：39、(1)本发明方法制备的两种双配体修饰的近红外二区发光金纳米粒子，合成方法简单，条件温和，产率高，易于工业化生产；40、(2)本发明方法制备的两种双配体修饰的近红外二区发光金纳米粒子，稳定性高，生物安全性好，肿瘤靶向性高，具有长时间肿瘤内富集和滞留，且存在长二区荧光成像窗口；41、(3)本发明方法制备的两种双配体修饰的近红外二区发光金纳米粒子通过主客体相互作用的方式在肿瘤细胞内形成纳米组装体，可将低光热转化效率的单分散aunps转化为具有高效光热转化效率的金纳米组装体，再结合超小金纳米粒子上修饰有微酸环境断键释放的化疗药物dox，可完成肿瘤部位的药物靶向递送和可控释放，实现肿瘤的化学与光热等联合治疗。本发明所提出两种双配体修饰的近红外二区发光金纳米粒子及组装体在治疗方面的策略，可以确保纳米载药体系的安全性，并进一步增强肿瘤的治疗效果，其在肿瘤治疗等领域具有良好的应用前景。