渗湿散结方源性细胞外囊泡颗粒在制备预防或治

本发明属于医药领域，涉及渗湿散结方源性细胞外囊泡颗粒的医药用途，具体涉及渗湿散结方源性细胞外囊泡颗粒在制备预防或治疗肺纤维化药物中的医药用途。背景技术：1、肺纤维化是多种间质性肺疾病的最终病理改变，其特征是长期弥漫性肺泡炎，成纤维细胞过度增殖，继而出现细胞外基质沉积过多，并逐渐取代正常肺组织，最终造成肺功能障碍，病人可能因呼吸衰竭而死亡。肺纤维化大体可分为原因已明(如放射线、药物、矽肺等)和原因未明(如特发性肺纤维化)两大类。研究认为病原微生物、粉尘、药物、化学制剂等多种因素均可诱导肺纤维化的发生，但其详细机制尚不清楚。肺纤维化可发生于任何年龄，全球发病率为7-10/10万，患者平均生存时间为3-4年，且随着年龄的增长，发病率逐渐增高而平均生存时间逐渐缩短。由此可见，肺纤维化严重危害人类的健康和生存，治疗肺纤维化药物的研究与开发显得十分重要。2、根据原因未明的分类，肺纤维化可细分为原发性肺纤维化、继发性肺纤维化、特发性肺纤维化、肺间质纤维化和间质性肺炎；其中肺间质纤维化有很多不同的种类，包括继发性肺间质纤维化(继发于免疫疾病如类风湿、干燥综合症等的肺间质纤维化)、药物性肺间质纤维化以及特发性肺间质纤维化等。肺间质纤维化大多由于病毒所致，主要为腺病毒、呼吸道合胞病毒，流感病毒、副流感病毒、麻疹病毒等。其中以腺病毒和流感病毒引起的间质性肺炎较多见，也较严重，常形成坏死性支气管炎及支气管肺炎，病程迁延易演变为慢性肺炎。3、肺间质纤维化病准确的概念称为间质性肺疾病(ild)，是一组主要累及肺间质、肺泡腔，导致肺泡、毛细血管功能丧失的弥漫性肺疾病，具有较高的发病率和死亡率。目前，糖皮质激素联合免疫抑制剂被认为是治疗间质性肺病的主要方法。然而，这种联合治疗增加了耶洛维奇肺囊虫肺炎的风险，这给临床医生带来了巨大的挑战。因此，迫切需要寻找安全有效的药物来治疗ild。4、中药因疗效突出、不良反应小而越来越受到重视。然而，复杂的成分和加工工艺也限制了其进一步的应用。渗湿散结方(sj)由红景天、鳖甲、薏苡仁三味中药组成，是临床上广泛应用于肺部疾病/肺纤维化治疗的著名方剂。但复杂的加工工艺和严格的储存条件限制了其在临床中的进一步应用。细胞外囊泡(extracellular vesicles,evs)含有多种蛋白质、脂质和核酸，可通过介导细胞与细胞之间的通讯发挥重要的生理功能，几乎所有类型的真核和原核细胞都分泌evs。植物evs在形态方面与哺乳动物evs相似，具有跨物种调节功能，不仅可以调节哺乳动物细胞的生理功能，还可以干预和预防疾病进程，对疾病起到治疗作用。这些研究结论证明植物evs作为一种新型的天然产物有可能成为新药开发的良好候选来源。然而目前还未见文献报道渗湿散结方源性细胞外囊泡，因此，从渗湿散结方中提取细胞外囊泡是否可行，提取出的细胞外囊泡是否具有生物活性或渗湿散结方的相关功能还未可知。5、因此，提供一种如何从渗湿散结方中提取细胞外囊泡的方法，并深入研究提取到的细胞外囊泡的功能，以发掘其在治疗肺纤维化方面的应用潜力，是具有意义的。技术实现思路1、针对现有技术的不足，本发明的目的在于提供了一种渗湿散结方源性细胞外囊泡纳米颗粒的制药用途，具体涉及渗湿散结方源性细胞外囊泡纳米颗粒在制备预防或治疗肺纤维化药物中的应用。2、本发明提供湿散结方源性细胞外囊泡颗粒及其制备方法以及在制备防治肺纤维化的药物中的应用。本发明提供的渗湿散结方源性细胞外囊泡颗粒通过抑制早期持续性炎症因子的释放，减弱晚期纤维化程度，对肺纤维化具有良好的治疗效果，且安全无毒，因此可用于制备防治肺纤维化的药物。3、为达到上述发明目的，本发明采用了如下技术方案：4、第一方面，本发明提供了渗湿散结方源性细胞外囊泡颗粒在制备防治肺纤维化的药物中的应用，所述药物的活性成分包括所述渗湿散结方源性细胞外囊泡颗粒。5、本发明获得了一种渗湿散结方源性细胞外囊泡样颗粒，并通过实验发现，渗湿散结方源性细胞外囊泡颗粒对于肺纤维化具有显著的治疗作用，并且安全无毒，可用于制成防治肺纤维化的药物。6、中草药配方渗湿散结方由三种草药组成:红景天(干燥的红景天)，鳖甲(trionyxsinensis wiegmann的背甲)和薏苡仁(干燥的薏苡仁)，其中，红景天15g、鳖甲15g、薏苡仁30g。7、本发明所述渗湿散结方源性细胞外囊泡样颗粒由渗湿散结方提取分离得到。8、本发明所述肺纤维化为原发性肺纤维化、继发性肺纤维化、特发性肺纤维化、肺间质纤维化和间质性肺炎。9、进一步地，所述肺间质纤维化为继发性肺间质纤维化、药物性肺间质纤维化或特发性肺间质纤维化。10、更进一步地，所述继发性肺间质纤维化为继发于免疫疾病如类风湿、干燥综合症等的肺间质纤维化。11、进一步地，所述肺间质纤维化为病毒所致肺间质纤维化。12、更进一步地，所述病毒为腺病毒、呼吸道合胞病毒，流感病毒、副流感病毒和/或麻疹病毒。13、更进一步地，所述病毒为腺病毒或流感病毒。14、结合第一方面，所述药物的剂型为口服制剂。15、优选地，所述防治肺纤维化的药物还包括药学上可接受的注射剂辅料或口服制剂辅料。具体辅料和相应的制备方法可根据注射剂或口服制剂的具体剂型进行常规选择，不对渗湿散结方源性细胞外囊泡颗粒的药理活性和理化稳定性产生不良影响且符合临床用药需求即可，本发明对此不做限定。16、第二方面，本发明提供了上述渗湿散结方源性细胞外囊泡颗粒的制备方法。17、本发明所述渗湿散结方源性细胞外囊泡颗粒的制备方法，包括以下步骤：18、步骤s1：渗湿散结方煎液的制备19、将干燥的红景天，鳖甲和薏苡仁切碎混合，用蒸馏水提取，采用粗提取系统。两次提取的上清液均质，即为渗湿散结方煎液提取液。20、步骤s2：渗湿散结方源性细胞外囊泡颗粒的分离21、用差速离心法从渗湿散结方煎液中分离出渗湿散结方源性细胞外囊泡。22、更进一步地，本发明所述渗湿散结方源性细胞外囊泡颗粒的制备方法，包括以下步骤：23、步骤s1：渗湿散结方煎液的制备24、将干燥的红景天，鳖甲和薏苡仁切碎混合，用蒸馏水提取，采用粗提取系统。两次提取的上清液均质，即为渗湿散结方煎液提取液。25、步骤s2：渗湿散结方源性细胞外囊泡颗粒的分离26、收集的渗湿散结方煎液提取液依次在1000×g离心5-15分钟→2000×g离心15-25分钟→3000×g离心25-35分钟→10000×g离心50-70分钟，去除大颗粒和细胞碎片。然后采用顺序超离心方法，将最终上清液在离心机上离心150000×g，离心1.5h-2.5h，将得到的颗粒在pbs中轻摇，在4℃下重新悬浮至少1h，即得渗湿散结方源性细胞外囊泡颗粒。27、进一步地，所述步骤s1中，红景天、鳖甲和薏苡仁的重量比为1:1:2。28、进一步地，所述步骤s1中，粗提取系统为95±5℃，第一次提取2-5h；95±5℃，第二次提取0.5-2h。29、进一步地，所述步骤s1中，粗提取系统为95℃，第一次提取3h；95℃，第二次提取1h。30、进一步地，所述步骤s2中，60g渗湿散结方使用约500-700μl培养基。31、更进一步地，所述步骤s2中，60g渗湿散结方使用600μl培养基。32、进一步地，所述步骤s2中，1000×g离心10分钟。33、进一步地，所述步骤s2中，2000×g离心20分钟。34、进一步地，所述步骤s2中，3000×g离心30分钟。35、进一步地，所述步骤s2中，10000×g离心60分钟。36、进一步地，所述步骤s2中，离心机为himac ultracenfuge cp100nx。37、进一步地，所述步骤s2中，150000×g，离心2h。38、进一步地，所述步骤s2中，得到的颗粒在600μl pbs中轻摇。39、进一步地，所述步骤s2中，得到的颗粒在4℃下重新悬浮1-5h。40、本发明所述渗湿散结方源性细胞外囊泡颗粒的制备方法，具体包括以下步骤：41、s1：渗湿散结方煎液的制备42、将干燥的红景天，鳖甲和薏苡仁切碎混合，用蒸馏水提取，采用粗提取系统，95±5℃，第一次提取3h；95±5℃，第二次提取1h。两次提取的上清液均质，即为渗湿散结方煎液提取液，保存于密闭容器中。43、s2：渗湿散结方源性细胞外囊泡颗粒的分离44、用差速离心法从渗湿散结方煎液，60g渗湿散结方使用600μl培养基，分离出细胞外囊泡。收集的23ml渗湿散结方煎液提取液依次在1000×g离心10分钟→2000×g离心20分钟→3000×g离心30分钟→10000×g离心60分钟，去除大颗粒和细胞碎片。然后进一步采用顺序超离心方法，包括将最终上清液在himac ultracenfuge cp100nx，ti45转子，离心150000×g，离心2h，将得到的颗粒在600μl pbs中轻摇，在4℃下重新悬浮至少1h，即得渗湿散结方源性细胞外囊泡颗粒。渗湿散结方源性细胞外囊泡的最终样品在-80℃保存。45、第三方面，本发明提供了一种渗湿散结方源性细胞外囊泡颗粒，该渗湿散结方源性细胞外囊泡颗粒是按上述制备方法制得。46、第四方面，本发明提供了一种防治肺纤维化的药物，所述药物的活性成分包括上述渗湿散结方源性细胞外囊泡颗粒。47、结合第四方面，所述肺纤维化为原发性肺纤维化、继发性肺纤维化、特发性肺纤维化、肺间质纤维化和间质性肺炎。48、进一步地，所述肺间质纤维化为继发性肺间质纤维化、药物性肺间质纤维化或特发性肺间质纤维化。49、更进一步地，所述继发性肺间质纤维化为继发于免疫疾病如类风湿、干燥综合症等的肺间质纤维化。50、进一步地，所述肺间质纤维化为病毒所致肺间质纤维化。51、更进一步地，所述病毒为腺病毒、呼吸道合胞病毒，流感病毒、副流感病毒和/或麻疹病毒。52、更进一步地，所述病毒为腺病毒或流感病毒。53、结合第四方面，所述防治肺纤维化的药物的剂型为注射剂或口服制剂。54、优选地，所述防治肺纤维化的药物还包括药学上可接受的注射剂辅料或口服制剂辅料。具体辅料和相应的制备方法可根据注射剂或口服制剂的具体剂型进行常规选择，不对渗湿散结方源性细胞外囊泡颗粒的药理活性和理化稳定性产生不良影响且符合临床用药需求即可，本发明对此不做限定。55、本发明药效实施例采用气管内注射博来霉素(blm)诱导小鼠肺纤维化模型研究渗湿散结方源性细胞外囊泡颗粒对肺纤维化，尤其是肺间质纤维化的治疗作用。实验结束后，第21天分别用masson三色染色、sirius红染色及elisa试剂盒检测大鼠体重、肺组织病理改变、肺纤维化程度及促纤维化细胞因子。第3天采用he染色和生化试剂检测局灶区浸润单核细胞、支气管肺泡灌洗液(balf)中炎症因子和总细胞数。体外实验中，采用tgf-β诱导a549细胞上皮-间质转化(epithelial-mesenchymal transition,emt)模型，评价渗湿散结方源性细胞外囊泡颗粒对肺泡上皮细胞的影响。采用western blot、创面愈合试验、免疫荧光等方法检测一系列指标。此外，采用流式细胞术和seahorse assay kit检测渗湿散结方源性细胞外囊泡颗粒在il-4活化的m2巨噬细胞模型上的抗纤维化作用。体内体外实验表明，渗湿散结方源性细胞外囊泡颗粒对于肺纤维化，尤其是肺间质纤维化，具有显著的治疗作用。56、本发明的有益效果是：本发明以渗湿散结方为原料，采用一系列高速和超离心分离渗湿散结方源性细胞外囊泡颗粒，并采用电镜、粒度分析仪和琼脂糖凝胶电泳对其进行表征。在体内研究中，渗湿散结方源性细胞外囊泡颗粒通过抑制早期持续性炎症因子的释放，减弱晚期纤维化程度，对肺纤维化具有良好的治疗效果。体外实验中，渗湿散结方源性细胞外囊泡颗粒可改善ros-nlrp3通路介导的a549细胞的emt。同时，渗湿散结方源性细胞外囊泡颗粒改善oxphos抑制m2复极化。渗湿散结方源性细胞外囊泡颗粒通过降低ros/nlrp3介导的atii细胞emt和抑制能量代谢介导的m2细胞极化来改善肺纤维化。