一种流感黏膜疫苗佐剂及其制备方法和应用

本发明涉及免疫学领域，特别涉及一种流感黏膜疫苗佐剂及其制备方法和应用。背景技术：1、h1n1流感是一种人畜共患的病毒，每年有较高的发病率和死亡率，给公共卫生和经济发展带来了相当大的负担。虽然注射流感疫苗可产生针对病毒感染的免疫保护作用，但黏膜免疫应答是有限的。值得注意的是，大量证据表明，在流感病毒的主要进入部位鼻腔建立黏膜免疫，可以有效地在第一时间预防流感病毒感染。例如，经鼻给药的减毒流感活疫苗可以引起强烈的体液和细胞免疫应答，但安全性问题、较差的稳定性和生产上的挑战仍然存在。相比而言，经鼻接种的灭活流感疫苗(iiv)具有良好的安全性，且在鼻黏液和血清中诱导抗体应答的能力更强，可作为一种潜在的替代方案。然而，iiv滴鼻疫苗的效果通常不理想，可能受到黏膜屏障、黏膜下树突状细胞(dendritic cells，dcs)数量不足和dcs成熟受限等多种因素的影响。黏膜屏障阻碍了黏膜下抗原提呈细胞(apcs)尤其是树突状细胞对疫苗的摄取，如黏液纤毛清除抗原、黏膜表面蛋白水解酶降解抗原、紧密上皮导致抗原渗透效率低下等。或者，鼻腔免疫后，抗原被黏膜组织驻留的dcs摄取，dcs进一步迁移至引流淋巴结，导致黏膜下层的dcs数量不足，无法摄取抗原来诱导保护性免疫。因此，迫切需要一种能够增强抗原在鼻腔内滞留、募集dcs至黏膜下层以增强抗原摄取并诱导dcs成熟的鼻腔疫苗佐剂。2、阳离子脂质体，由于其良好的安全性，以及利用黏膜表面的负电荷增加黏膜黏附和鼻驻留的能力，引起了人们的极大关注。然而，脂质体只能促进抗原的黏附和驻留并不能对黏膜下层的dc产生影响，这阻碍了其临床转化进展。3、锰(mn)作为一种必需的微量营养素，在各种生理和免疫过程中发挥着重要作用。尽管mn2+是环鸟苷酸-腺苷酸合成酶(cgas)干扰素基因(sting)信号通路的潜在激动剂，但其低稳定性限制了其进一步应用。4、近年来，基于细胞膜的仿生纳米平台在生物医学领域的应用备受关注，尤其是纳米佐剂。其中，自然杀伤细胞膜(mnk)以细胞膜蛋白(irgmi、galectin-12和rab-10)为基础，通过激活tlr4/nf-κb信号通路诱导dc成熟和巨噬细胞极化的能力更强。然而，低稳定性、货物的封装不足、尺寸的高度异质性阻碍了其进一步应用。技术实现思路1、有鉴于此，本发明提供了一种流感黏膜疫苗佐剂及其制备方法和应用。本发明将nk细胞膜(mnk)与包裹sting激动剂mno2 nps(lipomn)的阳离子脂质体高效融合制备了一种功能化的仿生鼻内疫苗纳米佐剂nlipomn，以实现协同增强iiv诱导的针对hin1流感的保护性免疫应答，为开发无针、保护性强的抗流感和其他呼吸道病毒感染的鼻内疫苗提供了一种有前景的、通用的纳米佐剂。2、为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：3、本发明提供了疫苗佐剂的制备方法，包括：取脂质体包裹二氧化锰纳米颗粒获得包裹二氧化锰纳米颗粒的脂质体，nk细胞膜与所述包裹二氧化锰纳米颗粒的脂质体融合获得所述疫苗佐剂。4、在本发明的一些具体实施方案中，所述脂质体包括dppc、胆固醇和dspe-peg2000。5、在本发明的一些具体实施方案中，所述制备方法包括如下步骤：6、步骤1、取dppc、胆固醇、dspe-peg2000、ddab和α-生育酚溶解于氯仿中，旋转蒸发，获得脂质体；7、步骤2、取所述脂质体和二氧化锰纳米颗粒水合，获得包裹二氧化锰的脂质体；8、步骤3、取所述包裹二氧化锰的脂质体和nk细胞膜，溶解，超声，搅拌获得所述疫苗佐剂。9、在本发明的一些具体实施方案中，所述dppc、胆固醇、dspe-peg2000、ddab和α-生育酚的质量比包括25:10.5:9.5:(2.35～9.4):0.3。10、在本发明的一些具体实施方案中，所述dppc、胆固醇、dspe-peg2000、ddab和α-生育酚的质量比包括25:10.5:9.5:4.7:0.3。11、在本发明的一些具体实施方案中，步骤3所述包裹二氧化锰的脂质体和nk细胞膜的质量比包括(1～10):1。12、在本发明的一些具体实施方案中，步骤3所述包裹二氧化锰的脂质体和nk细胞膜的质量比包括10:1。13、在本发明的一些具体实施方案中，步骤1所述旋转蒸发的转速包括30～180rpm。14、在本发明的一些具体实施方案中，步骤1所述旋转蒸发的转速包括120rpm。15、在本发明的一些具体实施方案中，步骤3所述超声的功率包括100w；所述超声的时间包括2min。16、在本发明的一些具体实施方案中，所述超声的条件包括功率100w，温度4℃，超声4min，工作5s，停止5s，总时间2min。17、在本发明的一些具体实施方案中，步骤2所述二氧化锰纳米颗粒的制备方法包括：取kmno4溶液和bsa混合反应，离心，获得上清液，透析，冻干，获得所述二氧化锰纳米颗粒。18、在本发明的一些具体实施方案中，以mg/ml计，所述bsa和kmno4溶液的质量体积比包括5:1；所述kmno4溶液的浓度包括1mm。19、在本发明的一些具体实施方案中，所述nk细胞膜的制备方法包括：取脾脏，均质，筛网过滤，获得脾细胞悬液；裂解红细胞，分离获得nk细胞，采用含有il-2的培养基培养，裂解细胞，离心，收集沉淀获得所述nk细胞膜。20、在本发明的一些具体实施方案中，所述il-2的浓度包括100u/ml。21、本发明还提供了所述制备方法获得的疫苗佐剂。22、本发明还提供了所述疫苗佐剂在如下任意项中的应用：23、(i)、制备疫苗；和/或24、(ii)、增强dc细胞对疫苗的摄取；和/或25、(iii)、促进dc细胞成熟；和/或26、(iv)、延长疫苗在鼻腔的停留时间；和/或27、(v)、辅助黏膜下dc的募集和摄取；和/或28、(vi)、制备增强免疫应答的产品。29、在本发明的一些具体实施方案中，所述疫苗包括流感疫苗。30、在本发明的一些具体实施方案中，所述流感疫苗包括h1n1流感病毒。31、在本发明的一些具体实施方案中，所述流感疫苗包括pr8 h1n1病毒和/或zc14h1n1病毒。32、在本发明的一些具体实施方案中，所述免疫应答包括黏膜免疫应答和/或系统免疫应答。33、在本发明的一些具体实施方案中，所述增强免疫应答包括增强诱导高滴度抗原特异性siga的能力、提高cd3+cd4+t细胞比例、提高cd8+ifn-γ+t细胞比例或提高cd19+igd+b细胞的比例中的一种或多种。34、在本发明的一些具体实施方案中，所述增强免疫应答包括增强诱导ha特异性igg的能力、增强th1型免疫应答、提高hai滴度、促进脾细胞增值、提高ifn-γ含量、提高cd3+cd4+t细胞比例或提高cd8+ifn-γ+t细胞比例中的一种或多种。35、本发明还提供了疫苗，包括所述疫苗佐剂。36、本发明还提供了所述疫苗佐剂、所述疫苗在制备预防呼吸道传染病的产品中的应用。37、在本发明的一些具体实施方案中，所述产品的使用方式包括吸入式或鼻喷式。38、本发明提供了包括但不限于提供了如下有益效果：39、本发明将nk细胞膜(mnk)与包裹sting激动剂mno2 nps(lipomn)的阳离子脂质体高效融合制备了一种功能化的仿生鼻内疫苗纳米佐剂nlipomn，以实现协同增强iiv诱导的针对hin1流感的保护性免疫应答。与传统流感黏膜佐剂霍乱毒素相比，nlipomn在继承了mnk和lipomn的优点的基础上，具有多种性能，如延长iiv的鼻腔滞留时间，利用tlr4和sting通路。值得注意的是，nlipomn通过激活黏膜内皮细胞的tlr4/nf-κb通路来上调ccl20的分泌，从而增强黏膜下dc的募集以摄取iiv。重要的是，nlipomn-iiv可以通过刺激tlr4/nf-κb通路来增强sting介导的免疫激活，从而促进体内外dc的成熟。值得注意的是，nlipomn-iiv具有良好的体外和体内安全性，在同源和异源的hini流感病毒攻击中显示出较其他制剂更强的黏膜和全身免疫应答。因此，本研究为开发无针、保护性强的抗流感和其他呼吸道病毒感染的鼻内疫苗提供了一种有前景的、通用的纳米佐剂。