一种层级多孔明胶纳米纤维微球支架及其制备方

本发明涉及生物支架，尤其是涉及一种层级多孔明胶纳米纤维微球支架及其制备方法和应用。背景技术：1、天然骨组织具有自我更新和修复的内在能力。然而，由于创伤、肿瘤和感染等各种原因导致的大范围骨缺损的治疗是一项艰巨的挑战，因为机体自身的再生能力往往不足以完全恢复组织的完整性。这一长期存在的临床难题凸显了对创新方法的迫切需求。三维（3d）打印以其定制复杂几何形状的能力而闻名，标志着组织再生领域的范式转变。与传统的生物支架相比，三维打印通过忠实地复制大型、复杂的组织结构，具有明显的优势。此外，3d打印技术为降低传统骨移植中固有的风险（包括与组织来源、免疫排斥和疾病传播相关的问题）提供了一条前景广阔的途径。2、目前用于骨组织工程三维打印的油墨主要分为两大类。首先是刚性材料，包括金属和无机材料，如钛合金、羟基磷灰石和磷酸钙陶瓷，这些材料在骨科结构加固方面得到了广泛应用。尽管这些材料具有良好的机械属性，但由于其体内降解性极差或降解动力学极其缓慢，再加上生物改性潜力有限，它们在骨组织再生方面的功效受到了阻碍。相反，软性材料，主要是由天然或合成聚合物制成的水凝胶，具有可调节的机械弹性、孔隙率和降解动力学，尤其是具有多方面生物改性能力和优异生物相容性的天然聚合物，在骨缺损再生方面具有显著优势。然而，必须承认生物体组织结构的复杂性和微妙性。目前三维打印技术和生物材料油墨的局限性使当前的三维打印只能模仿组织的宏观形状结构，在构建类似细胞外基质的层级多孔和纳米地形结构方面仍然存在挑战。这种固有的局限性导致3d打印支架主要由固体或笨重的丝状堆积结构组成，缺乏必要的层级多孔结构。这种结构阻碍了细胞渗入支架内部，从而阻碍了真正生物功能结构的实现，并因此限制了体内修复效果。为了应对这一挑战，现有技术通过在油墨中加入微凝胶等牺牲性多孔介质，从而在支架框架内形成相互连接的孔隙结构，促进细胞迁移。与此同时，相邻微凝胶之间的间隙也为微凝胶墨水带来了相互连接的空隙，这使得基于水凝胶微凝胶的干扰微凝胶生物支架日益受到关注。尽管在实现层级多孔性方面取得了显著进展，但在三维打印中实现纳米纤维结构仍存在重大障碍。技术实现思路1、本发明的目的在于提供一种层级多孔明胶纳米纤维微球支架及其制备方法和应用，以解决现有技术中存在的三维打印生物支架缺乏必要的层级多孔结构和纳米纤维结构的技术问题。本发明提供的诸多技术方案中的优选技术方案所能产生的诸多技术效果详见下文阐述。2、为实现上述目的，本发明提供了以下技术方案：3、第一方面，本发明提供了一种层级多孔明胶纳米纤维微球支架的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：4、（1）制备甲基丙烯酸明胶；5、（2）制备明胶纳米纤维微球：6、将所制备的甲基丙烯酸明胶溶解在50℃的乙醇和水混合溶剂中形成分散相，采用矿物油作为连续相，并对分散相和连续相的流速进行精确控制，将分散相和连续相通入微流控装置形成液滴，将形成的液滴输送至-20℃的正己烷/乙醇混合物中，然后在4℃的2-（n-吗啉基）乙烷磺酸缓冲液中与1-乙基-3-（3-二甲基氨基丙基）碳二亚胺盐酸盐和n-羟基琥珀酰亚胺进行交联反应，交联反应结束后中和残留的交联剂，然后用蒸馏水洗涤、冻干并储存备用，得到明胶纳米纤维微球；7、（3）制备层级多孔明胶纳米纤维微球支架：8、将pluronic f-127和irgacure 2959均质化以配制牺牲墨水，随后通过冷冻离心机将大小均匀的明胶纳米纤维微球掺入所配置的牺牲墨水中，将得到的混合物导入打印墨管，并保持在室温下形成三维打印墨水，采用生物打印机执行三维打印过程，然后进行紫外线交联程序，将三维打印的层级多孔明胶纳米纤维微球支架浸入4℃的蒸馏水中，去除牺牲油墨，得到具有纳米纤维结构的层级多孔支架。9、根据一种优选实施方式，所述的制备甲基丙烯酸明胶的步骤还包括：10、将10%（w/v）的明胶溶解于50℃的磷酸缓冲盐溶液（无钙镁）中，在剧烈搅拌下，将甲基丙烯酸酐引入明胶溶液中，反应1小时，最后用磷酸缓冲盐溶液（无钙镁）稀释，所得溶液使用12~14 kda的透析管进行透析，然后冻干并储存在-20℃以备用。11、根据一种优选实施方式，在制备明胶纳米纤维微球的步骤中，所述乙醇和水混合溶剂的体积比为：50/50（v/v），所述正己烷/乙醇的体积比为：75/25（v/v），所述交联反应的时间为48h。12、根据一种优选实施方式，所述的制备甲基丙烯酸明胶的步骤还包括：在交联反应结束后，将明胶纳米纤维微球在0.5 m甘氨酸溶液中孵育3小时，以中和残留的交联剂。13、根据一种优选实施方式，所述的制备层级多孔明胶纳米纤维微球支架的步骤还包括：14、使用混合器将质量浓度30%的pluronic f-127和质量浓度为1%的 irgacure 2959均质化，配制牺牲墨水，随后通过冷冻离心机将均匀的明胶纳米纤维微球掺入牺牲墨水中，然后将得到的混合物导入打印墨管，并保持在室温下，形成三维打印墨水，通过生物打印机执行三维打印过程，然后进行3分钟的紫外线交联程序，将三维打印的层级多孔明胶纳米纤维微球支架浸入4℃的蒸馏水中，去除牺牲油墨，得到具有纳米纤维结构的层级多孔支架。15、根据一种优选实施方式，所述明胶纳米纤维微球的直径为130-140微米。16、第二方面，本技术还提供了一种层级多孔明胶纳米纤维微球支架，所述层级多孔明胶纳米纤维微球支架是按照所述的制备方法制备而成。17、第三方面，本技术还提供了所述的层级多孔明胶纳米纤维微球支架在制备治疗骨组织损伤的药物中的应用。18、基于上述技术方案，本技术的层级多孔明胶纳米纤维微球支架及其制备方法和应用至少具有如下有益技术效果：19、本技术的制备方法首先是通过微流控技术和热致相分离的方法合成明胶纳米纤维微球，在制备过程中，甲基丙烯酸明胶溶液作为分散相，矿物油作为连续相，利用两种互不相溶的液体间的流体剪切力及表面张力相互作用，使甲基丙烯酸明胶溶液被矿物油切断形成大小均一的球形液滴，之后通过热致相分离结合非溶剂致相分离方法，利用明胶在水中易溶而在乙醇中不溶的特性，乙醇在热致相分离过程中充当非溶剂，使生成的微球具有纳米纤维和多孔结构。从而模拟了天然骨组织细胞外基质ecm的微物理结构和化学成分。与传统的乳化方法相比，通过微流控技术生产的明胶纳米纤维微球gmnf-ms具有更集中、更精确的粒度分布。通过调整连续相（gelma 溶液）和分散相（矿物油）之间的流速比，可以定制合成具有特定尺寸的微球。制造出了具有可定制尺寸、纳米纤维结构和孔隙率的明胶纳米纤维微球。然后将所制备的这些大小均匀的明胶纳米纤维微球作为挤压式三维打印墨水的基础构件，通过调节微球的尺寸，制造出具有可调节间隙空间的层级多孔明胶纳米纤维微球支架。将pluronic f127作为牺牲墨水，由于pluronic f127具有优异的流变特性，因此能够用于配制包含各种类型聚合物纳米纤维微球的墨水，这些微球能够在打印后发生交联，从而制造出具有纳米纤维结构的层级多孔支架。20、本技术制备的层级多孔明胶纳米纤维微球支架与传统块状水凝胶应用相比具有以下优势：本技术制备的明胶纳米纤维微球无需生物材料降解即可促进细胞迁移，从而提高了细胞浸润和增殖率。此外，明胶纳米纤维微球的纳米纤维拓扑结构提供了有利于引导干细胞成骨分化和ecm沉积的物理线索。体内研究将明胶纳米纤维微球用作临界大小颅骨缺损模型中外源性干细胞的载体，证明了明胶纳米纤维微球中相互连接的微米级孔隙和纳米纤维结构在减轻不良免疫反应、促进骨组织整合和再生方面的巨大潜力。使用明胶纳米纤维微球作为干细胞载体，可避免复杂的三维打印过程对预交联水凝胶前体中细胞的潜在不利影响，还可解决对打印的细胞负载水凝胶系统进行生物改性的难题。