一种多功能核酸纳米复合物及其制备方法与应用

本发明属于药物载体制备的，具体涉及一种多功能核酸纳米复合物及其制备方法与应用。背景技术：1、根据世卫组织最新发布的全球癌症统计报告，在女性癌症患者中，患乳腺癌的患者数量已经超过肺癌。乳腺癌的转移性疾病在5年后的生存率仅为23％，对女性健康构成了严重威胁。2、化疗是对于乳腺癌的治疗的主要手段之一。但是，常规的化疗药物治疗缺乏靶向性，需要全身给药，其使用量通常需要以病人身体最大耐受剂量加以控制。且化疗药物还具有半衰期短、生物利用度低和心脏毒性等缺点。因此，化疗药物对于乳腺癌的治疗效果较差，还会产生严重的毒副作用。3、近年来，纳米药物在提高肿瘤的诊断和治疗效果方面发挥了广泛的作用。纳米药物具有更强的通透性与保留效果，还能通过靶向癌症治疗系统直接与癌症细胞产生作用，相比常规化疗拥有更好的治疗效果。但是，目前常用的靶向癌症治疗系统主要通过单价分子的识别来进行，例如通过抗体和适配体与癌细胞受体直接的单一分子相互作用，存在靶向效率、细胞内吸收效果、选择性和整体杀伤效果等方面的不足。因此，目前缺少一种能够有效的靶向、释放且具有较好的生物相容性的药物载体。技术实现思路1、本发明的目的在于提供一种多功能核酸纳米复合物(rca-aunfs)，该复合物能够负载化疗药物，实现对肿瘤细胞的多价靶向，从而提高与癌细胞的相互作用强度和频率。2、本发明的目的之二在于提供所述多功能核酸纳米复合物的制备方法。3、本发明的目的之三在于提供所述多功能核酸纳米复合物在药物靶向递送中的应用。4、为了实现上述目的，本发明是通过以下技术方案实现的：5、本发明提供一种多功能核酸纳米复合物，所述复合物由金纳米花(aunfs)与锚定包覆在aunfs表面的rca产物构成。6、进一步的，所述rca产物通过滚环扩增技术(rca)扩增得到的dna链；所述rca产物中包含与环状dna模板互补的重复序列单元；所述重复序列单元包括聚腺嘌呤(polyan)序列片段、适配体序列片段、间隔域序列片段，其中n为碱基a的个数，5≤n≤20。7、进一步的，所述多功能核酸纳米复合物中金纳米花与rca产物的摩尔比为1：(3～5)。8、所述重复序列单元的核苷酸序列如seq id no:1所示，其中间隔域序列片段是针对化疗药物阿霉素所设计的。9、所述适配体序列片段的核苷酸序列如seq id no:2所示。10、所述polyan序列片段通过物理交联将rca产物锚定包覆在aunfs表面；适配体序列片段能特异性靶向肿瘤细胞表面受体；所述间隔域序列片段用于嵌入化疗药物，化疗药物包括但不限于阿霉素(dox)。11、本发明采用通过聚腺嘌呤(polyan)将dna长链锚定在aunps上，不仅可以使长链以较高的内在亲和力完全覆盖在金表面，而且这种共价键在生理条件下略微稳定，在响应连续波nir辐射下不稳定，可以有效地提供局部药物递送12、当化疗药物为阿霉素时，间隔域序列片段的核苷酸序列如seq id no:3所示。13、本发明提供的多功能核酸纳米复合物通过rca产物大量重复的适配体片段，实现对肿瘤细胞的多价靶向，从而提高与肿瘤细胞的相互作用强度和频率。另外，化疗药物(如阿霉素，dox)可以直接插入到rca产物中所述的间隔域，无需对药物或dna进行化学修饰。14、本发明还提供一种所述多功能核酸纳米复合物的制备方法，包括以下步骤：15、(1)金纳米花的制备：将苯二酚溶液、硝酸银溶液和氯金酸溶液依次加入聚乙烯吡咯烷酮溶液中，室温下搅拌反应，再滴加氯金酸溶液并振荡反应使溶液转变为棕色，反应完成后，加入浓氨水反应以去除氯化银模板，洗涤离心得到aunfs溶液；16、(2)rca产物的合成：将padlock dna进行退火处理后，加入rcaprimer和t4dna连接酶，充分混合，在室温下反应，再将灭活t4 dna连接酶，得到rcaprobe混合液；取dna聚合酶缓冲液、三磷酸脱氧核糖核苷酸混合液(dntps)、phi 29 dna聚合酶加入rcaprobe混合液中，恒温孵育，灭活聚合酶，得到rca产物；17、(3)多功能核酸纳米复合物的制备：将步骤(2)得到的rca产物与步骤(1)得到的aunfs溶液混合，使rca产物吸附于金纳米花，得到rca-aunfs。18、进一步的，步骤(1)具体为：将苯二酚溶液、硝酸银溶液和氯金酸溶液依次加入聚乙烯吡咯烷酮溶液中，室温下搅拌反应，再滴加氯金酸溶液并振荡反应使溶液转变为棕色，反应2～2.5h后，加入浓氨水反应1～1.5h以去除氯化银模板，洗涤离心得到aunfs溶液；所述洗涤离心的转速为10000～12000rps，时间为5～8min，共进行3～5次；所述金纳米花粒径为200～210nm。19、进一步的，步骤(2)中，所述将padlockdna进行退火处理具体为：将10μm的padlockdna溶液与10×t4dna连接酶反应液混合，体积比为1:(1～1.2)，在95℃水浴锅中加热5～10min，再冷却至室温。20、所述dna聚合酶缓冲液、dntps、phi 29 dna聚合酶、rcaprobe混合液与超纯水体积比为:(8～12)：(4～6)：(0.8～1.2)：(27～33)：(50～58)；所述恒温孵育的温度为34～40℃，时间为2～2.5h；21、进一步的，步骤(3)具体为将步骤(2)得到的rca产物加热90～100℃解旋，再加入到步骤(1)得到的aunfs溶液中，混匀，室温下孵育2h后，6000～8000rpm离心5～8min，去除上清液，将沉淀继续用超纯水洗涤3～5次，得到多功能核酸纳米复合物；所述rca产物的浓度为290～310nm，aunfs溶液浓度为0.30～0.33mg/ml；所述rca产物溶液与aunfs溶液体积比为1:(1～1.2)。22、一种所述多功能核酸纳米复合物在药物靶向递送中的应用。23、进一步的，当使用rca-aunfs负载化疗药物阿霉素时，将dox分子嵌入rca-aunfs的步骤具体为：先将rca-aunfs加入到阿霉素溶液中，所述rca-aunfs与dox的摩尔比为1：(50～80)，充分混匀，室温下搅拌过夜；再以490～510rpm离心5～8min，去除上清液，将所得沉淀用超纯水离心洗涤至上清液无色，收集沉淀得到dox@rca-aunfs。24、进一步的，当所述多功能核酸纳米复合物在嵌入化疗药物后，在传递药物过程中，使用功率为1.2～1.5 w/cm2，波长为808 nm的近红外光照射所述多功能核酸纳米复合物，使其在4～6min升温到60℃，且所述多功能核酸纳米复合物在预设ph与温度的环境中经近红外光照射会释放rca产物中嵌入的化疗药物。25、本发明的原理26、多功能核酸纳米复合物不仅具有多重功能的rca产物带来的多价靶向效应，还能发挥良好的光热效应。在外源nir刺激下，所述多功能核酸纳米复合物中的纳米金材料光热效能强，可以将光能转化成热能在较短时间内迅速升温到60℃，实现对药物的控制释放。通过所述制备方法制备得到的多功能核酸纳米复合物在嵌入化疗药物分子后，在rca产物上适配体片段的引导下靶向肿瘤细胞，同时肿瘤细胞微环境的特性会加速药物的释放，在nir/ph双重刺激条件下响应，实现时空可控、精确释放药物的效果。27、本发明的有益效果28、(1)本发明通过在rca产物上设计间隔域序列片段，使化疗药物分子能够嵌入dna双螺旋结构中，减少了非生物分子的使用，提高了生物相容性；29、(2)本发明通过在rca产物上设计polyan序列片段将载药的rca产物锚定在aunfs上，不仅可以使rca产物以较高的内在亲和力完全覆盖在aunfs表面，还能利用aunfs的nir性能通过光照实现药物的可控释放；30、(3)本发明直接通过rca技术扩增得到具有多重功能性的rca产物，操作简单，快捷灵敏，避免了酶的切割以及引入其他dna的副反应，且rca产物覆盖aunfs更为安全，提升了多功能核酸纳米复合物的生物相容性。