一种调控肿瘤乏氧和免疫抑制微环境的前药、纳

本发明属于药物制剂联合治疗新辅料和新剂型，具体涉及一种调控肿瘤乏氧和免疫抑制微环境的前药、纳米组装体、制备方法与应用。背景技术：1、近些年，免疫治疗在肿瘤临床治疗中广泛应用，癌症临床治疗方案也从传统手术切除、放疗和化疗向免疫治疗转换。阿霉素(dox)是广泛应用于癌症治疗的蒽环类化疗药物，它通过进入dna双螺旋结构并抑制拓扑异构酶i(top i)活性来发挥细胞毒性作用，促进癌细胞死亡。此外，dox在诱导肿瘤细胞凋亡的同时，还能够刺激濒死的肿瘤细胞释放损伤相关分子模式(damage associated molecular patterns,damps)，诱导肿瘤细胞发生免疫原性细胞死亡(icd)，进而激活抗肿瘤免疫反应。icd是一种特殊的细胞死亡形式，死亡的肿瘤细胞会释放damps，如钙网蛋白(crt)、高迁移率族蛋白b1(hmgb1)和三磷酸腺苷(atp)等。多种damps显著促进了树突状细胞(dc)的成熟和细胞毒性t淋巴细胞(ctls)的募集，从而激活抗肿瘤免疫反应，通过多种途径提高肿瘤细胞免疫原性进而增强治疗效果。icd前期、早期、中期，将死的肿瘤细胞通过自噬途径分泌的atp作为一种“find me”信号，与抗原递呈细胞(apcs)上的离子型(p2x7)和代谢型(p2y2)嘌呤受体结合，刺激apcs的成熟和趋化诱导。icd前期，内质网(er)分子伴侣crt转位至细胞膜表面，作为“eat me”信号，被吞噬细胞表面的cd91受体识别，并促进dc细胞成熟，刺激dc细胞吞噬将死的肿瘤细胞。icd晚期，hmgb1从将死的肿瘤细胞细胞核中释放出来与dc细胞上的toll样受体4(toll-like receptor 4，tlr4)的结合，激活dc细胞并促进dc细胞向t细胞呈递抗原。tlr4结合hmgb1后触发了tlr4/myd88信号通路，通过抑制吞噬体和溶酶体之间的融合来增强肿瘤抗原，并加速dc细胞对抗原成分的吞噬。2、尽管化疗-免疫疗法具有临床应用潜力，仍然存在一些亟待解决的问题和挑战。其中，肿瘤乏氧微环境不仅导致免疫抑制微环境的形成，还会显著抑制化疗药物的抗肿瘤活性和icd诱导能力。由于肿瘤血管异常、血流波动和氧气扩散不足等因素，实体肿瘤常以乏氧微环境为特征。正常组织的氧气分压在10-80mm hg之间，而大多数的实体肿瘤的氧气分压小于5mm hg，远低于正常组织的氧分压水平，这严重限制了icd诱导剂触发的抗肿瘤免疫反应的效果。在乏氧条件下，肿瘤衍生的细胞因子能够将肿瘤相关巨噬细胞(tam)转化为具有免疫抑制活性的m2型巨噬细胞，从而促进肿瘤生长并导致免疫抵抗。此外，在乏氧微环境下，乏氧诱导因子hif-1可以直接调节髓系来源的抑制性细胞(mdscs)的功能和分化，进而促进免疫耐受。3、除了乏氧挑战，肿瘤内特定的细胞会适应免疫环境的变化并抵抗免疫攻击，限制了化疗-免疫疗法作用的发挥。这些被统称为“适应性免疫抵抗”(air)的机制，是癌细胞经历长时间适应并能够多样化的结果。其中，瘤内浸润的细胞毒性t淋巴细胞分泌的干扰素-γ(ifn-γ)会通过janus激酶/信号换能器和激活因子反离子(jak-stat)信号通路，上调肿瘤细胞程序性死亡配体-1(pd-l1)的表达。pd-l1与细胞毒性t淋巴细胞上的程序性细胞死亡蛋白1(pd-l)结合，通过pd-1-pd-l1通路使效应t细胞失活，从而诱导肿瘤细胞进行免疫逃避，并诱发肿瘤细胞对化疗免疫治疗产生适应性抵抗。4、由于发现了肿瘤乏氧对其治疗的严重限制，在过去的几十年里，研究者们致力于开发不同的策略用于有效缓解肿瘤乏氧，以增强肿瘤化疗-免疫疗法效果。这些方法主要包括过氧化氢酶介导的细胞内h2o2分解来原位产氧，以及通过抑制线粒体呼吸来抑制细胞耗氧。尽管取得了一些成功，但上述方法绝大多数依赖于内在不足的氧含量和h2o2水平，这极大地降低了它们改善肿瘤氧合的能力。相比之下，外源性供氧可能是一种更有希望有效改善肿瘤乏氧微环境的策略。研究者们利用血红蛋白、小球藻、金属有机框架(mofs)等作为氧气载体向肿瘤部位递送氧气以缓解肿瘤乏氧。然而，常用的氧载体如血红蛋白和金属有机框架，分别因其自身氧化和金属原子引起的严重副作用而长期受到批评。近年来，具有多氟原子取代的全氟化碳(pfcs)由于具有良好的生物相容性和较高的载氧能力而广泛应用于向肿瘤部位递送外源性氧气以缓解肿瘤乏氧。由于氟原子的取代，pfcs具有较高的化学和生物惰性，与体内内源性物质不发生相互作用，对人体几乎不产生影响，在生物医学方面曾用于骨科植入和血管结构置换，具有良好的生物相容性。因氟原子对空间的要求，迫使pfcs的碳链骨架以螺旋的方式排列，同时由于pfcs与氧具有相近的hildebrandt系数以及自身的低内聚能和较弱的分子间作用力导致其对氧气具有较高溶解度，因此已被广泛用于氧气递送以缓解肿瘤乏氧。尽管pfcs有许多明显的优势，但其高度疏水性和含pfcs的聚合物材料的可用性仍对其临床转化提出了挑战，特别是静脉注射使用。5、为了克服乏氧抑制dox诱导icd效应而限制其抗肿瘤效果的缺陷，我们设想将其设计成氟化dox前药进行外源性氧气供应。然而前期的工作表明仅通过氧气递送无法有效解决由于pd-l1的过表达而造成的免疫抑制，这主要是由于除乏氧造成pd-l1过表达外，还有文献报道通过dox诱导的抗肿瘤免疫反应导致瘤内浸润的ctls会分泌干扰素-γ，这种促炎细胞因子会进一步促进pd-l1的表达。据报道，溴域和额外末端蛋白(bet)抑制剂如jq1可在转录阶段通过抑制ifn-γ触发的pd-l1表达来抑制免疫逃逸。在机制上，bet抑制剂通过减少brd4在pd-l1位点的占用，显著抑制pd-l1的转录，而不依赖于转录因子c-myc。然而，由于bet抑制剂的水溶性较差和从血液中快速清除，其临床应用仍然具有挑战性。因此，为了增强dox介导的免疫反应并缓解免疫抵抗，构建高效的药物递送系统以同步共递送pfcs以及jq1是必要的。技术实现思路1、基于现有技术存在的问题，本发明提供了一种调控肿瘤乏氧和免疫抑制微环境前药、纳米组装体、制备方法与应用。具体来说，本发明开发了一种基于dox二硫键桥连氟化前药(dssf)和溴域及额外末端蛋白(bet)抑制剂(jq1)的无载体二元杂化纳米组装体(dssfjonas)。值得注意的是，dssf中的氟化侧链不仅有利于dssf/jq1共组装，而且使纳米组装体具有良好的载氧能力。在此设计中，dox作为icd诱导剂有效激活抗肿瘤免疫反应，显著促进肿瘤内细胞毒性t淋巴细胞(ctls)的浸润。与此同时，dssf中氟化侧链改善肿瘤乏氧微环境，通过供氧降低乏氧诱导的免疫抵抗。此外，二硫键触发的jq1释放可以有效抑制由于乏氧和ifn-γ诱导的pd-l1上调，进一步逆转适应性免疫抵抗。正如预期的那样，该纳米组装体在4t1乳腺癌荷瘤小鼠模型中表现出强大的抗肿瘤作用。综上所述，本发明研究了一种高效低毒的肿瘤治疗策略，本研究为肿瘤化疗免疫治疗联合应用以增强免疫反应和缓解免疫抵抗提供了一种新的纳米治疗范式。2、本发明通过以下技术方案实现上述目的：3、第一方面，本发明提供了一种调控肿瘤乏氧和免疫抑制微环境的前药，其特征在于，所述前药为蒽环类化疗药物与氟化侧链化合物通过肿瘤环境敏感键连接，结构通式如式ⅰ所示：4、5、式ⅰ中，x为肿瘤环境敏感键，r为氟化侧链。6、进一步地，所述蒽环类化疗药物包括阿霉素、表阿霉素、阿柔比星或柔红霉素。7、进一步地，所述氟化侧链化合物包括全氟烷基乙醇、全氟己基乙基醇、2,2,3,4,4,4-六氟-1-丁醇、3,3,4,4,5,5,5-七氟-1-戊醇、八氟戊醇、4,4,5,5,6,6,7,7,8,8,8-十一氟辛烷-1-醇、1h,1h,2h,2h-十三氟-1-正辛醇、2,2,3,3,4,4,5,5,6,6,7,7,8,8,8-十五氟辛-1-醇、1h,1h,2h,2h-全氟十二烷-1-醇1,1,2,2-四氢全氟十四醇、1.2,2,3,3,4,4,4-七氟丁胺、1h,1h-九氟戊胺、1h,1h-十一氟己胺、1h,1h-全氟辛基胺、4,4,5,5,6,6,7,7,8,8,9,9,10,10,11,11,11-十七氟十一胺或1h,1h,2h,2h-全氟癸基胺。8、进一步地，所述肿瘤环境敏感键为ph敏感键或氧化还原环境敏感键，所述ph敏感键包括腙键或碳酸酯键，所述氧化还原环境敏感键包括单硫醚键、二硫醚键、二硫键、三硫键或金属蛋白酶敏感键。9、优选地，调控肿瘤乏氧和免疫抑制微环境的前药，其特征在于，所述前药的化学结构式如式ⅱ所示：10、11、第二方面，本发明提供了所述的调控肿瘤乏氧和免疫抑制微环境的前药的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：12、首先将二硫代二乙酸、3,3'-二硫代二丙酸或4,4'-二硫代二丁酸成酸酐，然后与所述氟化侧链化合物发生酰化反应得到中间产物1；13、所述蒽环类化疗药物与所述中间产物1发生酰化反应，即得。14、第三方面，本发明提供了一种调控肿瘤乏氧和免疫抑制微环境的无载体杂化纳米组装体，所述无载体杂化纳米组装体由所述前药、jq1和peg修饰剂共组装而成。15、进一步地，所述无载体杂化纳米组装体的制备方法包括：将所述前药、jq1与peg修饰剂溶解到溶剂中，搅拌下，将该溶液缓缓滴加到水中，即可自发形成粒径均匀的peg修饰的纳米粒，除去溶剂后即得。16、进一步地，所述peg修饰剂为dspe-peg、tpgs、pcl-peg、plga-peg或pe-peg，所述peg修饰剂的分子量为500-10000；17、所述前药与jq1的摩尔比为5:1～1:5，优选为1:1；18、所述前药与jq1之和与peg修饰剂的质量比为10:90～90:10。19、本发明还提供了一种氧气饱和的无载体杂化纳米组装体的制备方法，包括如下步骤：20、将dox前药、jq1和peg修饰剂，溶解到到适量的无水乙醇中，涡旋条件下，将有机试剂缓缓滴加到去离子水中，自发形成均匀的纳米粒，然后除去溶剂，即得由dox前药、jq1和peg修饰剂共组装而成的无载体杂化纳米组装体。此外，将o2以恒定流量(5l/min)充入所制备的无载体杂化纳米组装体30min，即得到氧气饱和的无载体杂化纳米组装体。21、在上述制备方法中，除去溶剂的方法包括溶剂蒸发法、超滤法或膜渗透法。22、进一步地，所述peg修饰剂优选为dspe-peg2k。23、进一步地，优选的溶剂为无水乙醇。24、进一步地，dox前药和jq1的摩尔比优化为1:1。25、第四方面，本发明提供了无载体杂化纳米组装体在制备药物递送系统中的应用。26、第五方面，本发明提供了无载体杂化纳米组装体在制备抗肿瘤药物中的应用。27、进一步地，所述药物传递系统或所述抗肿瘤药物的给药形式包括注射给药、口服给药或局部给药。28、本发明相对于现有技术具有的有益效果如下：29、1.本发明制备得杂化纳米组装体，可用于调控肿瘤乏氧和免疫抑制微环境以增强化疗-免疫联合治疗效果，氟化模块不仅可以促进dssf和jq1组装，而且赋予纳米组装体高效和稳定的氧气负载和传递。此外，与jq1的共组装不仅保持了纳米组件的载氧效率，而且提高了其缓解免疫抵抗的效率。30、2.本发明的dssf和jq1共组装形成的杂化纳米组装体实现了载药量高、稳定性好、毒副作用低等技术效果，满足临床中对高效低毒制剂的迫切需求，为肿瘤化疗免疫治疗联合应用以增强免疫反应和缓解免疫抵抗提供了一种新的纳米治疗范式。