一种基于PLGA的OVA-aPD1纳米/微米球混合制剂及其制

本发明属于生物，具体涉及一种基于plga的ova-apd1纳米/微米球混合制剂及其制备方法和应用。背景技术：1、慢性乙型肝炎病毒(hepatitis b virus，hbv)在原发性肝细胞癌(hepatocellular carcinoma，hcc)的发生发展中起重要作用，全球50％-80％肝癌患者与hbv感染相关；手术切除是早期肝细胞肝癌的理想治疗手段，但大部分肝癌患者通常在晚期确诊，多数患者已失去手术机会。程序性死亡受体(programmed death-1，pd-1)及其配体(programmed deathligand 1，pd-l1)，在抑制细胞程序性死亡的过程中发挥重要作用，近年来免疫治疗为其提供了新的希望。2、本研究组前期利用质谱流式细胞技术(mass cytometry，cytof)对hbv病毒感染诱发肝癌(hbv+hcc)和非病毒诱发肝癌(non-viral hcc)患者的肝脏原位肿瘤、癌旁组织内所有免疫细胞亚型分布进行检测。分析发现较non-viral hcc患者，hbv+hcc患者的癌旁组织中特异性高表达pd-1+组织驻留记忆cd8+ t细胞(pd1hicd103+cd69+cd8+，pd-1hicd8+trms)。hbv+hcc患者体内免疫细胞受hbv抗原和肿瘤抗原的双重刺激，基于四聚体技术及流式细胞术初步发现hbv+hcc患者无论肿瘤还是癌旁，cd8+trms细胞的pd-1表达量显著高于组织其他cd8+ t细胞亚型，并且在hbv+hcc患者组织内，病毒特异性pd-1hicd8+trms细胞主要滞留于癌旁。3、组织驻留t细胞(trm)是长期驻留于非淋巴组织中并对驻留点实行长期免疫监视的一类特殊的免疫记忆细胞，为病原体入侵外周屏障组织提供一线防御。alvaro lladser等发现有效激活小鼠皮肤内抗原特异性trm可促进树突状细胞(dendritic cells，dcs)成熟，进而促进肿瘤内抗原特异性cd8+ t的活化和增殖，有效抑制黑色素瘤增长。4、基于兼具良好生物相容性和低毒性聚合材料为载体的肝靶向给药系统(hepatictargeted drug delivery system，htdds)是近年来研究肝病靶向治疗的热点。htdds可分被动型和主动型两种，其中主动型则是利用配体-受体或抗原-抗体特异性结合原理对载体进行靶向修饰，定向地将药物传递到特定的组织和细胞。聚乳酸-聚羟基乙酸(poly(lactic-co-glycolic acid)，plga)具有良好生物相容性而被用于多种药物、疫苗靶向递送载体的研发，基于此载体递送结核疫苗，可在目的部位安全的缓释抗原持续刺激机体免疫系统，同时plga纳米/微米球还具有一定的免疫佐剂作用。技术实现思路1、因此，本发明拟以plga为载体构建纳米/微米球混合制剂ova-apd1n.m.p，其内包封小鼠pd-1抗体同时表面修饰ova(257-264)；验证ova-apd1 n.m.p靶向激活肝脏非肿瘤抗原特异性cd8+trms细胞的治疗策略在增强肿瘤免疫治疗中的积极干预功能，为广大肿瘤患者的治疗提供新的思路。2、本发明的技术方案如下：3、本发明提供了一种基于plga的ova-apd1纳米/微米球混合制剂，该制剂包括：聚乳酸-聚羟基乙酸纳米颗粒和聚乳酸-聚羟基乙酸微米颗粒混合粒、抗pd-1抗体和卵清蛋白多肽的257-264位组成的肽段；4、所述聚乳酸-聚羟基乙酸纳米颗粒和聚乳酸-聚羟基乙酸微米颗粒混合粒作为靶向递送载体内部包载有所述抗pd-1抗体、表面修饰有所述卵清蛋白多肽的257-264位组成的肽段。5、优选的，所述纳米颗粒的粒径为200nm，所述微米颗粒的粒径为1μm。6、本发明提供了双乳化法制备ova-apd1 n.m.p，并且选用聚乳酸-聚羟基乙酸纳米、微米颗粒混合微粒作为疫苗靶向递送载体。7、优选的，每毫克的ova-apd1纳米/微米球混合制剂包含的抗pd-1抗体和卵清蛋白多肽的257-264位组成的肽段的浓度分别为40μg/mg和238μg/mg。8、本发明还提供了所述基于plga的ova-apd1纳米/微米球混合制剂的制备方法，包括以下步骤：9、(1)将聚乳酸-聚羟基乙酸溶于有机溶剂中，得到油相；10、(2)将抗pd-1抗体加入油相中，进行超声，得到初乳；11、(3)将卵清蛋白和表面活化剂加入初乳中，超声或高速匀浆，分别得到含有聚乳酸-聚羟基乙酸纳米颗粒或微米颗粒的复乳；12、(4)将分别得到的复乳去除其中的有机溶剂，离心收集的颗粒，用双蒸水洗涤，聚乳酸-聚羟基乙酸纳米颗粒和聚乳酸-聚羟基乙酸微米颗粒混合得到所述基于plga的ova-apd1纳米/微米球混合制剂。13、优选的，所述聚乳酸-聚羟基乙酸、抗pd-1抗体、卵清蛋白的比例为1000∶40∶238；聚乳酸-聚羟基乙酸纳米颗粒和聚乳酸-聚羟基乙酸微米颗粒混合的质量比为1∶1。所述表面活化剂为胆酸钠。14、所述超声的条件为在45w超声1.5分钟，所述高速匀浆的转速为3000rpm。15、本发明还提供了所述ova-apd1纳米/微米球混合制剂在制备用于治疗原发性肝癌的药物中的应用。16、ova-apd1 n.m.p制剂可有效增强bmdcs的抗原内吞及抗原提呈，并可有效促进bmdcs和raw 264.7的活化。17、在本发明的实施例中，肝癌小鼠分别接种生理盐水、裸ova-apd1、ova-apd1 n.m.p制剂，每隔7天小鼠眼眶取血检测血清中总igg、igg1、igg2a和血清中il-2、ifn-γ细胞因子的浓度。接种后14天、28天、42天，提取小鼠肝的淋巴细胞，用流式细胞分析技术测定耗竭型及活化型ova特异性cd8+trms。ova-apd1 n.m.p疫苗可激活肝内非肿瘤特异性cd8+trms细胞后逆转肿瘤免疫抑制微环境，促进肿瘤抗原特异性cd8+ t细胞增殖活化，继而抑制肿瘤的增长。18、本发明为了研究肝组织驻留cd8+t细胞的变化，在肝癌小鼠模型造模3周后，注射抗小鼠cd8+t细胞抗体消除体内循环cd8+t细胞；并验证疫苗接种后肝内cd8+trms的增殖。19、优选的，所述原发性肝癌由慢性乙型肝炎病毒诱发。20、本发明还提供了一种治疗原发性肝癌的药物，活性成分为所述ova-apd1纳米/微米球混合制剂。药物给药方式为静脉注射。21、本发明的有益效果：22、本发明提供的一种以plga纳米(nps)/微米球(mps)为载体，其内包封抗pd-1抗体(apd1)，表面修饰ova(257-264)的特异性肿瘤疫苗制剂ova-apd1 n.m.p。ova-apd1 n.m.p可激活肝内非肿瘤抗原特异性cd8+trm细胞，同时通过细胞因子间接增强肿瘤抗原特异性cd8+t细胞的抗肿瘤免疫功能，抑制肝肿瘤增殖，为乙型肝炎病毒诱发的原发性肝细胞癌患者的免疫治疗提供新的研究方向。