结核亚单位疫苗LT20的制备及应用

本发明涉及一种结核亚单位疫苗及其制备方法。背景技术：1、结核病(tuberculosis,tb)主要由结核分枝杆菌(mycobacterium tuberculosis，mtb)感染引起，是威胁全球公共卫生的一种慢性传染性疾病。新生儿接种卡介苗(bacillecalmette-guérin，bcg)对预防儿童粟粒型结核和结核性脑膜炎有较好的保护作用，但对成人的保护效果不佳。重组蛋白亚单位疫苗具有成分明确、安全性好、易于制备等特点。为有效防治结核病，亟需研发结核亚单位疫苗。2、多数研究发现，结核亚单位疫苗的保护效果较好。由ag85b、esat-6和rv2660c构建的新型多期重组融合蛋白疫苗h56(ag85b-esat6-rv2660c)，在cb6f1小鼠中，相比单个抗原疫苗ag85b、esat-6和rv2660c及ag85b-esat6和bcg，h56的免疫原性和保护效果都较好。bcg接种后h56/ic31加强免疫可提高结核菌攻击后保护食蟹猴的生存率，能控制结核菌感染及潜伏性结核病。由rv1813c、rv2608、rv3619c和rv3620c四种结核菌抗原及gla-se佐剂组成的id93+gla-se疫苗，在一项针对结核病患者的iia期试验中的安全性和免疫原性是可行的。一种热稳定的id93+gla-se疫苗在健康成人中的是安全的和免疫原性也是可行的。m72/as01e疫苗是由mtb32a和mtb39a及结合佐剂系统as01组成，且m72/as01e疫苗进行的iib期试验，对感染结核菌的成人保护效果较好，且安全性能可靠。可见，构建的结核亚单位疫苗取得了很好的进展。技术实现思路1、为了解决现有技术中存在的问题，本发明提供了一种结核亚单位疫苗及其制备方法。2、本申请发明人发现，结核分枝杆菌细胞壁的糖脂成分丰富，富含分枝菌酸(mycolic acid，ma)、阿拉伯半乳糖(arabinogalactan，ag)、肽聚糖(peptidoglycan，pg)、海藻糖单霉菌酸酯(trehalose monomycolate，tmm)、海藻糖二霉菌酸酯(trehalosedimycolate，tdm)、磷脂酰肌醇甘露糖苷(phosphatidyl-myo-inositol mannoside，pim)和脂阿拉伯甘露聚糖(lipoarabinomannan，lam)等成分。据研究发现，结核菌细胞壁表面也富有促进细菌黏附和入侵宿主的黏附素成分，如ag85复合物、hbha、pili等抗原成分。结核分枝杆菌ag85复合物、38kda蛋白、lam等抗原可诱导机体产生显著的体液免疫反应，并可用于结核病的诊断。位于结核分枝杆菌细胞壁荚膜层、外膜层、肽聚糖层和细胞膜层的不同的糖脂成分及细胞壁抗原在诱导机体的体液免疫应答、进行单克隆抗体的研究及对结核病防治和诊断意义重大。结核分枝杆菌细胞壁成分丰富多样，富含有许多抗原成分，有些抗原属于结核分枝杆菌表面的黏附素，有助于结核菌黏附和入侵宿主细胞。筛选优势结核分枝杆菌细胞壁相关抗原，为结核亚单位疫苗的构建作铺垫。3、本申请发明人发现，菌毛pili是多数细菌病原体表面延伸出非鞭毛的长丝状结构，参与细菌与宿主的黏附和入侵；结核菌菌毛(mtp)由rv3312a编码，是结核菌黏附和入侵巨噬细胞的重要粘附素；mtp在体外与层粘连蛋白结合，可被活动性结核病患者igg抗体识别；是一种毒力因子，也是可靠的床旁检测的生物标志物；其缺乏会减少细胞壁生物合成中代谢物的利用、降低脂肪酸分解和减弱氨基酸生物合成。肝素结合血凝素(hbha)是结核分枝杆菌分泌的毒力因子，也是黏附素，与上皮细胞而非巨噬细胞相互作用，有助于结核病的肺外播散；促进细菌间的相互作用以及细菌与宿主的黏附；抗hbha igm抗体中和了结核分枝杆菌对上皮细胞的附着和侵袭；在结核病潜伏感染患者中诱导强烈的th1反应和细胞毒性t细胞(cytotoxic t lymphocyte,ctl)反应，是一种有吸引力的候选疫苗。可见mtp和hbha是较好的结核分枝杆菌候选抗原。4、实验室前期构建展示hbha和mtp优势表位的流感病毒样颗粒lv20，且lv20联合dp佐剂免疫小鼠后，免疫原性和保护效果较好。但lv20的构建成本高、程序相对复杂，需进一步优化和改进。根据筛选出的抗原hbha和mtp的特点及生物信息学预测结果，选择hbhap109-199和mtpp27-103构建无标签融合蛋白lt20(hbhap109-199-linker-mtpp27-103)。构建pet30a(+)-lt20(hbhap109-199-linker-mtpp27-103)重组质粒，利用大肠杆菌e.coli bl21(de3)表达lt20蛋白，探究lt20的纯化方式，在小鼠模型中评估lt20联合dp佐剂的免疫原性和保护效果。5、作为优选，所述编码融合蛋白lt20的基因序列为序列表seq id no.1。6、作为优选，所述表达载体为原核表达载体；作为进一步优选，所述原核表达载体为pet30a。7、作为优选，所述宿主细胞为大肠杆菌e.colibl21(de3)。8、作为优选，所述融合蛋白lt20的氨基酸序列为序列表seq id no.2。9、作为优选，所述融合蛋白lt20的纯化方法为：首先将融合蛋白lt20的菌体破碎离心后收集上清，使用离子交换层析柱纯化上清，获得目的蛋白。10、作为优选，所述佐剂由polyi:c和dda组成；所述polyi:c和dda的重量比为1：5。11、本发明还提供上述的结核亚单位疫苗的制备方法，蛋白联合佐剂制备结核亚单位疫苗。12、本发明还提供上述的结核亚单位疫苗免疫小鼠后，诱导的细胞免疫和体液免疫应答。13、本发明还提供上述的结核亚单位疫苗在预防分枝杆菌感染中的应用。14、本发明提供融合蛋白lt20的构建、制备，及亚单位疫苗lt20/dp的效果评价。采用本发明所提供的结核亚单位疫苗，可在小鼠体内有效诱导抗原特异性的细胞和体液免疫应答，同时，该疫苗可以介导小鼠针对大剂量bcg感染后的保护。该疫苗有望成为一种新型的结核亚单位疫苗。技术特征：1.一种结核分枝杆菌的结核亚单位疫苗，其特征在于：包含两个抗原，通过基因工程技术将基因hbhap109-199、linker即抗体铰链区(epkscdkthtcppcp)、mtpp27-103重组入原核表达载体构建融合蛋白lt20。2.根据权利要求1所述结核亚单位疫苗，其特征在于：重组融合蛋白的构建载体为pet30a，重组融合蛋白为hbhap109-199-linker-mtpp27-103(简称为lt20)。3.编码权利要求1或2中所述的融合蛋白lt20的基因分子；作为优选，所述编码融合蛋白lt20的基因序列为序列表seq id no.1。4.包含权利要求3所述基因的表达载体；作为优选，所述表达载体为原核表达载体；作为进一步优选，所述原核表达载体为pet30a。5.包含权利要求4所述载体的宿主细胞；作为优选，所述宿主细胞为大肠杆菌e.colibl21(de3)。6.根据权利要求1或2所述的结核亚单位疫苗，其特征在于：所述融合蛋白lt20的氨基酸序列为序列表seq id no.2。7.根据权利要求1或2所述的结核亚单位疫苗，其特征在于，融合蛋白lt20的表达和纯化；8.根据权利要求1或2所述的结核亚单位疫苗，其特征在于：所述佐剂由polyi:c和dda组成；所述polyi:c和dda的重量比为1：5。9.权利要求1-8中任一项所述的结核亚单位疫苗的制备方法，其特征在于：用pbs缓冲液溶解polyi:c粉末；用pbs缓冲液溶解dda粉末，于80℃水浴助溶10min，待冷却至室温以备用；以体积比1：1混合蛋白和poly i:c溶液；再以体积比1：1逐滴加入dda溶液于上述混合液中，获得呈均一乳油状的亚单位疫苗。10.权利要求8或9所述的结核亚单位疫苗在抗结核预防性疫苗中的用途。11.权利要求9中用途，其特征在于：所述疫苗的配制及通过滴鼻和皮下接种的方式免疫。12.权利力要求8或9所述重组蛋白疫苗lt20联合dp佐剂在抗结核预防中应用。技术总结本发明公开了结核亚单位疫苗LT20的制备及应用，发明人选择细胞壁抗原肝素结合血凝黏附素HBHA免疫优势序列(HBHA