一种免疫调控水凝胶系统及其制备方法和应用与

本发明涉及药物制剂，尤其涉及一种免疫调控水凝胶系统及其制备方法和应用。具体地，上述水凝胶系统以纤维蛋白原为基础，联合负载吡非尼酮(pfd)和免疫激动剂，免疫激动剂由磷酸钙载体负载siido1和索拉非尼(sfn)。背景技术：1、手术是癌症(例如肾癌、肝癌等，尤其是肾透明细胞癌)的一线治疗方法，然而，化疗和放疗反应不佳以及手术切除后高达40％的复发率仍是亟待解决的关键临床问题。肿瘤微环境中独特的僵硬和纤维化基质以及细胞代谢的改变有利于肿瘤细胞的存活，削弱免疫反应，支持肿瘤的免疫逃避。活化的肿瘤相关成纤维细胞能建立和重塑细胞外基质结构，不仅形成物理屏障阻碍药物递送和免疫细胞的浸润，还能分泌大量转化生长因子，降低t细胞反应，招募免疫抑制细胞，协助肿瘤免疫逃避。2、ido1是一种内源性免疫抑制介质，通过消耗肿瘤微环境中的色氨酸来刺激调节性t细胞的聚集并抑制t细胞的活性，从而介导肿瘤细胞的免疫逃逸。针对ido1的小分子抑制剂或sirna容易在血液循环过程中被快速清除，诱发抗性突变和脱靶结合毒性。更重要的是，体内给药可能会带来额外的叠加副作用。因此，一种既能使肿瘤物理微环境正常化，又能干扰不良肿瘤免疫代谢途径的治疗方案有望提高复发性肾癌的应答率。3、随着纳米技术的快速发展，通过自组装或共载多种治疗成分的一体化纳米平台可以作为对抗实体肿瘤的有效药物递送系统。其中，磷酸钙纳米系统在药物传递和肿瘤治疗等领域引起了广泛的研究。研究表明，磷酸钙纳米制剂因其高生物安全性、生物相容性、酸响应性释放和溶酶体逃逸能力而成为一种很有前途的基因传递载体，其高比表面积、肿瘤微环境响应性降解特性使得其能够同时装载大量的多种类药物并实现可控的肿瘤特异性释放。同时，水凝胶是三维网络结构的高分子体系，具有可调控的理化性质，利于药物递送，并能够实现包载药物的持续释放，提高体内给药稳定性。考虑到手术切除是肾癌患者的主要临床干预措施，在切除腔内原位植入水凝胶以及浓缩磷酸钙纳米制剂可能是一种有效的给药方法。4、因此，寻找将不同类型的治疗药物与具有免疫调节作用的小干扰rna药物负载于同一载体中以实现有效的配合，并进行高效地靶向递送，对于癌症治疗具有重要的发展意义。技术实现思路1、为了克服现有技术中存在的至少一个问题，本发明构建了一种具有肿瘤机械微环境重塑和免疫代谢阻断双重功能的免疫调控水凝胶系统cise-pfd@gel，该系统是由抗纤维化药物吡非尼酮(pfd)和免疫激动剂cise纳米颗粒通过纤维蛋白凝胶化组装而成，免疫激动剂是由磷酸钙、siido1和索拉非尼(sfn)通过物理吸附形式组装而成。上述以纤维蛋白原为基础的免疫调控水凝胶系统，作为pfd和免疫激动剂cise联合给药的载体，创建了一个免疫刺激龛，攻击残余肿瘤细胞，抑制肾癌术后复发。2、为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：3、本发明的第一个方面是提供一种免疫激动剂，其为cap-siido1-sfn-cd62e纳米颗粒(简称cise或cise纳米颗粒或cise nps)，其在磷酸钙载体上负载索拉非尼(sfn)和siido1，在所述磷酸钙载体的外壳上修饰cd62e蛋白。4、进一步地，所述索拉非尼的负载率为70～85％，所述siido1的负载率为40～60％。在一具体实施方案中，所述索拉非尼的负载率为78.6％，所述siido1的负载率为49.5％。上述负载率为负载至载体上的药物量与初始加入的药物量的比例。5、进一步地，制备所述免疫激动剂时，阴离子脂质包覆的磷酸钙(cap)核心是通过油包水微乳液法制备。6、进一步地，所述免疫激动剂的制备方法包括：7、步骤s1、将预定量的cacl2和siido1分散在第一油相溶液中，形成分散的油包水型反向微乳液；将预定量的na2hpo4和dopa添加至第二油相溶液中，得到磷酸盐相溶液；8、步骤s2、将步骤s1获得的油包水型反向微乳液和磷酸盐相溶液混合，获得第一混合溶液；向第一混合溶液中加入乙醇，离心去除油相组分，得到cap-siido1(ci)纳米颗粒；9、步骤s3、将步骤s2获得的cap-siido1纳米颗粒洗涤，采用氯仿溶解，获得预定浓度的cap-siido1纳米颗粒溶液；将预定量的cap-siido1纳米颗粒溶液与预定质量比的dmpc、胆固醇、dspe-peg-2000和索拉非尼进行混合，得到第二混合溶液；10、步骤s4、将步骤s3获得的第二混合溶液蒸发去除氯仿，向其加入tris-hcl缓冲液将剩余的脂质分散，制备获得cap-siido1-sfn(cis)纳米颗粒溶液；11、步骤s5、将步骤s4获得的cap-siido1-sfn纳米颗粒溶液与cd62e蛋白共孵育，使cd62e蛋白引入cap-siido1-sfn纳米颗粒的表面，形成免疫激动剂cap-siido1-sfn-cd62e(cise)纳米颗粒。12、进一步地，所述步骤s1中，所述siido1可采用本领域中任一合适的针对ido1的sirna，也可替换为本领域常规使用的针对ido1的小分子抑制剂。13、进一步地，在一具体实施方案中，所述siido1正义链的序列如seq id no.1所示，所述siido1反义链的序列如seq id no..2所示。14、具体序列信息如下(5’-3’)：15、siido1正义链：gcaauaguagauacuuacatt(seq id no.1)；16、siido1反义链：uguaaguaucuacuauugc tt(seq id no.2)。17、进一步地，所述步骤s1中，所述第一油相溶液和第二油相溶液均为环己烷/igepalco-520溶液。环己烷/igepal co-520溶液的体积配比优选60：40～80：20，更优选体积配比为71：29。18、进一步地，所述步骤s2中，所述乙醇为纯乙醇，去除的所述油相组分为环己烷和igepal co-520。19、进一步地，在将cd62e蛋白引入cap-siido1-sfn纳米颗粒的表面后，还包括收集cap-siido1-sfn-cd62e纳米颗粒的步骤，其通过薄膜水化法制备，并通过聚碳酸酯膜进行挤出。20、进一步地，所述步骤s1中，浓度为400～600mm的cacl2、浓度为1～3mg/ml的siido1、第一油相溶液的体积比为4～8：1～3：200～400；优选浓度为500mm的cacl2、浓度为3mg/ml的siido1、第一油相溶液的体积比为4～6：1.5～2.5：250～350；更优选浓度为500mm的cacl2、浓度为3mg/ml的siido1、第一油相溶液的体积比为6：2：300。21、进一步地，所述步骤s1中，浓度为15～30mm的na2hpo4、浓度为10～30mg/ml的dopa、第二油相溶液的体积比为4～8：2～6：200～400；优选浓度为20～25mm的na2hpo4、浓度为15～25mg/ml的dopa、第二油相溶液的体积比为5～7：3～5：：250～350；更优选浓度为25mm的na2hpo4、浓度为20mg/ml的dopa、第二油相溶液的体积比为6：4：300。22、进一步地，所述步骤s2中，乙醇与油相溶液的体积比为1：0.8～1.5，优选1：0.9～1.2，更优选1：1，所述油相溶液的体积为第一油相溶液和第二油相溶液的体积和；离心条件为：在10,000～15,000×g的转速下离心10～30min，优选在12,000×g的转速下离心20min。23、进一步地，所述步骤s3中，洗涤条件为以乙醇为溶剂充分洗涤2～4次，优选以乙醇为溶剂充分洗涤3次；氯仿的用量为5～10ml(优选5ml)，cap-siido1纳米颗粒溶液中cap-siido1纳米颗粒的终浓度为10～30mm，优选终浓度为20mm；cap-siido1纳米颗粒溶液的用量与dmpc、胆固醇、dspe-peg-2000和索拉非尼的总质量的比例为5～15ml：20～40mg，优选cap-siido1纳米颗粒溶液的用量与dmpc、胆固醇、dspe-peg-2000和索拉非尼的总质量的比例为5ml：30mg，其中dmpc、胆固醇、dspe-peg-2000和索拉非尼的质量比为2～4：0.5～2：0.5～2：0.2～1，优选质量比3：1：1：0.5。。24、进一步地，所述步骤s4中，tris-hcl缓冲液与cap-siido1纳米颗粒溶液的体积比为0.5～0.8：5～10，优选体积比为0.6～0.9：5～8，更优选体积比为0.8：5。上述tris-hcl缓冲液可为浓度5mm，ph 7.4。25、进一步地，所述步骤s5中，共孵育的步骤具体包括：将cap-siido1-sfn纳米颗粒溶液与his标记的cd62e蛋白以体积比8～12：0.5～2(优选体积比10：1)在37℃共孵育1h，4℃条件下过夜。26、进一步地，收集cap-siido1-sfn-cd62e纳米颗粒的步骤具体包括：使用旋转蒸发仪旋蒸除去有机溶剂，产生一层薄的脂质薄膜；采用超纯水对干燥脂质薄膜进行水化，并使cap-siido1-sfn-cd62e纳米颗粒膜溶解到水中；使用超声仪对溶液进行超声处理，直到溶液变得澄清；使用聚碳酸酯膜和挤出机，对cap-siido1-sfn-cd62e纳米颗粒进行反复挤出，将收集的cap-siido1-sfn-cd62e纳米颗粒置于4℃冰箱避光存储。27、进一步地，制备所得的cise纳米颗粒的平均粒径约为80～150nm，在一具体实施方案中，其平均粒径约为120nm。28、进一步地，制备的cise纳米颗粒具有灵敏的tme酸响应性降解和药物释放能力。29、本发明的第二个方面是提供一种含有本发明的第一个方面中任一所述的免疫激动剂的免疫调控水凝胶系统。30、进一步地，所述水凝胶系统为cise-pfd@gel，其由吡非尼酮和cap-siido1-sfn-cd62e纳米颗粒通过纤维蛋白凝胶化组装。31、进一步地，所述水凝胶系统的制备方法包括：32、步骤1)将纤维蛋白原配制成预定浓度的溶液，将预定浓度的cap-siido1-sfn-cd62e纳米颗粒溶液和预定浓度的吡非尼酮与纤维蛋白原溶液充分混合，恒温溶解预定时间，获得第一前体溶液；33、步骤2)将凝血酶配制成预定浓度的溶液，形成第二前体溶液；34、步骤3)将步骤1)中的第一前体溶液和步骤2)中的第二前体溶液按预定比例混合，催化凝胶，形成免疫调控水凝胶系统cise-pfd@gel。35、进一步地，所述步骤1)中，将纤维蛋白原在超声下溶于pbs溶液中，其中纤维蛋白原与pbs溶液的比例为30～60mg：0.5～2ml，然后置于35～40℃水浴中轻轻搅拌20～40min，获得纤维蛋白原溶液；优选，将纤维蛋白原在超声下溶于pbs中，其中纤维蛋白原与pbs的比例为50mg：1ml，然后置于37水浴中轻轻搅拌30min，获得纤维蛋白原溶液。36、进一步地，所述步骤1)中，浓度为0.8～1.5mg/ml cap-siido1-sfn-cd62e纳米颗粒溶液(优选浓度为1mg/ml，采用pbs溶液溶解收集储存的cap-siido1-sfn-cd62e纳米颗粒)、浓度为0.4～0.8mg/ml吡非尼酮(优选浓度为0.6mg/ml)、浓度为40～60mg/ml纤维蛋白原溶液(优选浓度为50mg/ml)的混合体积比为2～3：2～3：8～12(优选体积比为2：2：10)；恒温溶解的条件为置于35～40℃预热的生理盐水或水浴锅中20～40min，优选置于37℃预热的生理盐水或水浴锅中30min。37、进一步地，所述步骤2)中，采用pbs溶液将凝血酶配制成浓度为400～600u/ml的溶液；优选配制成浓度为500u/ml凝血酶溶液。上述pbs溶液中含25～30mg/l nacl，6～9mg/lcacl2，ph 7.5～8.5；优选pbs溶液含26.3mg/l nacl，7.7mg/l cacl2，ph 8.0。38、进一步地，所述步骤3)中，第一前体溶液和第二前体溶液的混合体积比为1～4：0.5～3；优选混合体积比为1.5～3：0.5～1.5，更优选混合体积比为2：1；催化凝胶的条件为35～40℃催化2～5min，优选37℃催化3min。39、进一步地，在所述免疫调控水凝胶系统cise-pfd@gel中，pfd的负载率为85～100％，cise纳米颗粒的负载率为80％-100％；在一具体实施方案中，pfd的负载率为100％，cise纳米颗粒的负载率为100％。40、进一步地，所述凝血酶选自人凝血酶、牛凝血酶、兔凝血酶、鼠凝血酶、羊凝血酶及其他种属来源凝血酶中的至少一种；优选采用牛凝血酶(高活力，>2000iu/mg)。41、进一步地，所述纤维蛋白原选自人纤维蛋白原、牛纤维蛋白原、兔纤维蛋白原、鼠纤维蛋白原、羊纤维蛋白原及其他种属来源纤维蛋白原中的至少一种；优选牛纤维蛋白原。42、进一步地，上述使用的pbs溶液可替换为0.9％ nacl溶液。43、本发明的第三个方面提供一种本发明的第一个方面中任一所述的免疫激动剂、或本发明的第二个方面中任一所述的免疫调控水凝胶系统的应用，其选自以下应用中的至少一种：在制备肿瘤机械微环境重塑药物中的应用、在制备免疫代谢阻断药物中的应用、在制备治疗癌症的药物中的应用、在制备抑制癌症术后复发的药物中的应用、在制备抑制癌症肺转移的药物中的应用。44、进一步地，所述癌症包括肾癌(肾透明细胞癌)、前列腺癌、结肠癌、肝癌等。45、进一步地，在应用过程中，免疫调控水凝胶系统以注射制剂的形式使用，具体为通过注射器注射。46、进一步地，在小鼠中，所述水凝胶系统的施用量为150μl，其有效药物量为pfd＝20mg/kg，sfn＝10mg/kg和siido1＝0.85mg/kg。47、可理解的是，本发明中涉及的机械免疫代谢治疗策略可扩展到具有类似属性的其他实体瘤，有望在常规治疗后作为辅助疗法应用。48、与现有技术相比，本发明采用上述技术方案具有以下有益效果：49、(1)传统的抗肿瘤药物使用的剂量高，毒副作用大，本发明制备的免疫调控水凝胶生物相容性极佳，所有成分均通过美国食品及药物管理局(fda)认证，在治疗剂量下毒性可忽略不计；(2)传统的给药方式受到硬化的肿瘤物理微环境的限制，药物递送效果不佳，本发明制备的水凝胶系统通过腔内给药提供了一种安全、方便、高效的方法，可与临床手术剥离无缝结合，无需额外手术即可级联刺激热杀瘤免疫；；(3)传统的免疫治疗忽视了围术期免疫抑制微环境，导致疗效不佳，本发明中水凝胶系统通过降低tregs和mdscs，促进m2型巨噬细胞向m1型巨噬细胞极化，促使术后免疫抑制微环境逆转为免疫刺激微环境，有利于实现增强的疗效；(4)本发明中免疫调控水凝胶系统能够重塑肿瘤机械微环境和阻断免疫代谢以增强肿瘤免疫原性，从而产生炎性免疫龛，优化抗肿瘤免疫反应；在局部用药时，该系统对切除腔周围的残余肿瘤细胞具有显著的靶向性，不仅能有效抑制肾癌术后复发，还能抑制肺转移，全身毒性几乎可以忽略不计。50、本发明构建的免疫调控水凝胶系统cise-pfd@gel具有良好的体内降解性和药物缓释特性，可有效增强抗肿瘤免疫力，有望兼容临床外科实践，，与临床手术剥离无缝结合，无需额外手术即可级联刺激热杀瘤免疫，上述联合疗法可作为一种通用策略，在“免疫排斥”型肿瘤术后干预中赋予高效的杀瘤免疫力，具有广泛的应用前景。