一种基于益生菌发酵的石榴皮三萜提取物的制备

本发明属于化合物提取领域，具体涉及一种基于益生菌发酵的石榴皮三萜提取物的制备方法及所得产物、应用。背景技术：1、益生菌发酵是天然产物结构修饰与药效增强的重要生物技术手段。发酵是传统中药加工炮制的重要方法之一，益生菌发酵是利用益生菌细胞产生的多元化酶系对中药化合物进行水解、氧化还原、羟基化等催化反应，产生新的活性化合物、提高活性化合物的含量和生物利用度等，为新药开发提供更有价值的先导化合物。且益生菌转化酶具有安全、高效、成本低、副反应少和条件温和等优点。2、石榴为石榴科石榴属植物，石榴皮为石榴的干燥果皮，是中国常用的中草药之一，早在《本草纲目》中就有记载，石榴皮酸、温、涩、无毒，对痢疾、胃痛腹泻和恶性肿瘤有治疗作用。石榴皮中含有丰富的三萜类化合物，但是现有技术中，多直接采用醇提等方法，石榴皮的利用度及药效较低，如何提高石榴皮中三萜类化合物的提取率，提高其利用度及药效，成为了亟待解决的问题。技术实现思路1、针对现有技术中存在的问题，本发明提供了一种基于益生菌发酵的石榴皮三萜提取物的制备方法，该提取物通过对石榴皮进行益生菌发酵，并对其中的三萜进行提取纯化而得。2、本发明还提供了一种上述基于益生菌发酵的石榴皮三萜提取物的制备方法制备得到的产物。3、本发明的另一目的为提供了上述基于益生菌发酵的石榴皮三萜提取物的应用。4、本发明为了实现上述目的所采用的技术方案为：5、本发明提供了一种基于益生菌发酵的石榴皮三萜提取物的制备方法，包括以下步骤：6、（1）发酵：将石榴皮粉和蒸馏水混合后灭菌，然后接种植物乳杆菌种子液，厌氧培养，发酵结束后进行菌株灭活，将发酵液进行过滤，浓缩，得发酵浸膏；7、（2）超声提取：在发酵浸膏中加入乙醇溶液，超声提取得乙醇提取液；8、（3）纯化：浓缩、冷冻干燥乙醇提取液得乙醇粗提物样品，加水溶解，得样品溶液，用d101大孔树脂对样品溶液进行纯化，分别用不同浓度的乙醇溶液对样品溶液进行梯度洗脱，分析测定后，浓缩、冷冻干燥得各组分乙醇洗脱液样品。9、进一步的，步骤（1）中，所述石榴皮粉和蒸馏水的料液比为1g：20-25ml；所述植物乳杆菌种子液的浓度为108cfu/ml；所述石榴皮粉和植物乳杆菌种子液的比例为5g：1ml。10、进一步的，步骤（1）中，所述厌氧培养为在37℃、摇床转速80 r/min、初始ph6.5的条件下培养72h。11、进一步的，步骤（2）中，所述乙醇溶液的浓度为88%；所述发酵浸膏和乙醇溶液的料液比为1g：30ml。12、进一步的，所述超声为56℃下超声提取60 min。13、进一步的，步骤（3）中，浓缩、冷冻干燥乙醇提取液得乙醇粗提物样品，纯化过程中，样品上样量为1.5 g，样品溶液的浓度25 mg/ml，洗脱体积7 bv（柱床体积），洗脱流速2bv/h，每个柱体积100 ml。14、进一步的，步骤（3）中，所述梯度洗脱用乙醇溶液的浓度为0、15%、30%、50%；所述乙醇洗脱液为15%乙醇洗脱液。15、本发明还提供了一种利用上述制备方法得到的基于益生菌发酵的石榴皮三萜提取物，所述石榴皮三萜提取物包括积雪草酸、科罗索酸、山楂酸、熊果酸、白桦脂酸、齐墩果酸、人参皂苷ro、山楂酸、川续断皂苷b、异杧果醇酸、路路通酸、葫芦素i和刺梨苷组成。16、本发明还提供了上述石榴皮三萜提取物在制备抗肿瘤药物中的应用。17、本发明以石榴皮为原料，采用植物乳杆菌进行发酵，利用超声辅助乙醇提取法对石榴皮中的三萜进行提取，利用d-101大孔吸附树脂对其进行纯化，并通过lc-ms/ms分析鉴定了石榴皮三萜提取物的结构。随后选用h460细胞癌症模型研究石榴皮三萜提取物的体外抗肿瘤活性。18、本发明的有益效果为：19、（1）本发明提供的制备方法，首先将石榴皮利用植物乳杆菌进行发酵，能够提高石榴皮中三萜类化合物的提取率，提高石榴皮的利用度，提高药效；20、（2）本发明将得到的提取物通过lc-ms/ms对石榴皮三萜组分进行结构鉴定，三萜含量最高的为积雪草酸、科罗索酸、山楂酸。通过体外细胞实验显示，石榴皮三萜能有效的抑制癌细胞的增殖，石榴皮三萜能有效的促进癌细胞凋亡。这些结果提示石榴皮三萜具有肿瘤辅助治疗的潜力，为石榴皮的进一步开发利用奠定了基础。技术特征：1.一种基于益生菌发酵的石榴皮三萜提取物的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤（1）中，所述石榴皮粉和蒸馏水的料液比为1g：20-25ml；所述植物乳杆菌种子液的浓度为108 cfu/ml；所述石榴皮粉和植物乳杆菌种子液的比例为5g：1ml。3.根据权利要求1或2所述的制备方法，其特征在于，所述厌氧培养为在37℃、摇床转速80 r/min、初始ph6.5的条件下培养72h。4.根据权利要求1-3任一项所述的制备方法，其特征在于，步骤（2）中，所述乙醇溶液的浓度为88%；所述发酵浸膏和乙醇溶液的料液比为1g：30ml。5.根据权利要求1或4所述的制备方法，其特征在于，所述超声为56℃下超声提取60min。6.根据权利要求1-5任一项所述的制备方法，其特征在于，步骤（3）中，纯化过程中，样品上样量为1.5 g，样品溶液的浓度25 mg/ml，洗脱体积7 bv（柱床体积），洗脱流速2 bv/h，每个柱体积100 ml。7.根据权利要求1或6所述的制备方法，其特征在于，步骤（3）中，所述梯度洗脱用乙醇溶液的浓度为0、15%、30%、50%；所述乙醇洗脱液为15%乙醇洗脱液。8.一种利用权利要求1-7任一项所述的制备方法得到的基于益生菌发酵的石榴皮三萜提取物，其特征在于，所述石榴皮三萜提取物包括积雪草酸、科罗索酸、山楂酸、熊果酸、白桦脂酸、齐墩果酸、人参皂苷ro、山楂酸、川续断皂苷b、异杧果醇酸、路路通酸、葫芦素i和刺梨苷组成。9.一种如权利要求8所述的石榴皮三萜提取物在制备抗肿瘤药物中的应用。技术总结本发明属于化合物提取领域，具体涉及一种基于益生菌发酵的石榴皮三萜提取物的制备方法及所得产物、应用。该方法首先将石榴皮粉进行发酵，然后在发酵浸膏中加入乙醇溶液，超声提取得乙醇提取液，经D101大孔树脂纯化即可。本发明提供的制备方法，首先将石榴皮利用植物乳杆菌进行发酵，能够提高石榴皮中三萜类化合物的提取率，提高石榴皮的利用度，提高药效；本发明将得到的提取物通过LC‑MS/MS对石榴皮三萜组分进行结构鉴定，三萜含量最高的为积雪草酸、科罗索酸、山楂酸。通过体外细胞实验显示，石榴皮三萜能有效的抑制癌细胞的增殖，石榴皮三萜能有效的促进癌细胞凋亡。这些结果提示石榴皮三萜具有肿瘤辅助治疗的潜力，为石榴皮的进一步开发利用奠定了基础。技术研发人员：孙金月,张梦启,刘超,周荣飞,郭溆,李慧民,周桂花受保护的技术使用者：山东省农业科学院技术研发日：技术公布日：2024/8/15