抗原的稳定乳剂的制作方法

发明领域本发明涉及疫苗学领域，更具体地说是兽医疫苗学领域。具体而言，本发明涉及一种佐剂组合物，其包含水乳剂、生育酚或其药学上可接受的酯、和作为乳化剂的聚乙氧基乙烯鲸蜡硬脂基醚。所述佐剂组合物可用于配制疫苗，特别是乳剂疫苗，包括细菌、寄生虫和/或病毒抗原。所得疫苗组合物可用于保护人或动物目标免受由病原体引起的(特别是由细菌、寄生虫或病毒引起的)感染和/或疾病的方法中。本发明还涉及用于制备此类佐剂组合物和制备此类疫苗组合物的方法。简介自文明开始以来就已知道病原体细菌、寄生虫或病毒感染及其引起的疾病，它们影响人类和动物，对健康和福祉造成严重影响。自20世纪中叶以来，细菌感染可以用抗生素药物有效治疗，尽管耐药性的累积是一个持续的威胁。农业部门畜牧业使用抗生素的情况很特殊：一方面，由于动物饲养方式和条件导致感染压力高，迫切需要治疗。另一方面，普遍的非治疗性抗生素使用(例如在动物饲料中使用)现在被认为是细菌耐药性增加的原因之一，这也与人类健康有关。因此，这种普遍使用的抗生素正在越来越多的国家逐步淘汰。预防性使用抗寄生虫药物的情况也类似。在病毒感染的情况下，情况更具挑战性，因为使用抗病毒药物对于兽医来说通常过于昂贵。除了改进农场管理之外，以可持续的方式对抗病原体感染和疾病的最佳选择是接种疫苗。细菌、寄生虫和病毒疫苗(无论是用于人还是动物)已为人所知超过一个世纪，并且有多种形式。此类疫苗可以是活的，即含有复制性(减毒)细菌、寄生虫或病毒，也可以是非活的，即包含灭活的细菌、寄生虫或病毒，或其组分中的一种或多种。包含非活(即非复制)抗原的疫苗通常需要佐剂来为非活抗原提供免疫刺激。在兽医疫苗中，可以使用多种化合物作为佐剂，例如：矿物油，例如bayoltm或markoltm、montanidetm或石蜡油；非矿物油，例如鲨烯、角鲨烯或植物油，例如油酸乙酯；铝盐，例如氢氧化铝或磷酸铝；肽，例如二甲基甘氨酸或tuftsin；细菌细胞壁组分，例如脂质a和胞壁酰二肽；(合成)聚合物，例如pluronics、右旋糖酐、carbomeres、吡喃或皂苷；细胞因子；和toll样受体刺激剂，例如包含非甲基化cpg基团的免疫刺激性寡脱氧核苷酸；等。为了便于施用和增强佐剂效果，油佐剂可以用水相中的抗原乳化以形成乳剂，该乳剂又可用于制备疫苗。在这种乳剂中，一个液相分散在另一个液相中，通常是油包水(w/o)或水包油(o/w)型乳剂。选择一种或另一种类型的乳剂可以基于例如所需的免疫反应类型。要产生并维持这种乳剂需要输入机械能和化学能：在适当的装置中，使用一定水平的剪切力、压力和温度将单独的液体混合，以将一个相分散到另一个相中。化学能的输入是通过使用乳化剂(也称为表面活性剂)提供的，乳化剂通过占据水和油的界面来稳定分散相。疫苗乳剂可以由一种或多种佐剂与一种或多种乳化剂组成。可用于乳剂疫苗中的乳化剂种类繁多，而且还在不断开发更多的乳化剂。商业兽医疫苗中使用的佐剂和乳化剂组合的实例有：(zoetis)，其包含轻质矿物油和卵磷脂作为乳化剂；(以前称为：microsol-diluvacmsd animal health)，其包含佐剂轻质矿物油和维生素e醋酸酯的组合，以及乳化剂80(聚山梨酯80或聚氧乙烯山梨糖醇酐单油酸酯)；以及(zoetis)，其包含角鲨烷、(聚氧乙烯和聚氧丙烯嵌段的非离子三嵌段共聚物)和tween80；(又名diluvac)，包含维生素e醋酸酯和tween 80；sp-oiltm(pluronictm、角鲨烷和tween)；以及as03tm(gsk)，其包含2.1％w/v角鲨烯和2.4％w/v维生素e，以及1.0％w/vtween 80作为乳化剂。用作疫苗的乳剂应是稳定的且不会“破裂”，这意味着分散相的液滴类型、大小和数量不应随时间发生太大变化，否则最终会导致分散性降低，并最终导致完全相分离。保持乳剂的稳定性对于保证乳剂疫苗在其注册保质期内的使用和有效性非常重要。重力随时间的影响(例如沉淀或乳化)是无害的，可以通过用手摇晃轻松逆转。然而，乳剂的实际破裂是不可逆的，由此导致的相分布不理想可能导致剂量不正确、安全问题，并可能影响疫苗抗原的免疫效力。除了对疫苗安全性和有效性的首要要求外，畜牧业中使用的疫苗还有一些特殊要求。这些涉及易用性方面，尤其是成本方面。这是因为动物蛋白的生产通常是一个高产量、低利润的企业。出于这些原因，兽医疫苗通常会同时针对几种疾病或病原体，通过在单一疫苗制剂中包含几种不同的抗原。这有利于减少目标动物因需要重复治疗而产生的压力，并减少施用的人工成本。目前，市场上有针对大量病原体和所有主要动物目标群体(猪、牛、羊、家禽、伴侣动物(例如猫、狗、马)和鱼)的含有细菌、寄生虫和/或病毒抗原的油佐剂乳剂疫苗。然而，并非所有所需的抗原选择都可以配制成稳定的乳剂疫苗。这是因为需要使用于农业的疫苗价格合理，即：这种疫苗通常不含有昂贵的纯组分(例如重组表达的亚单位)，并且不能使用复杂的纯化技术(例如柱色谱法)生产。实际上，这意味着此类疫苗中包含的非活抗原通常相对不纯，且成分有些不明确。与市场价值更高的疫苗产品(例如用于伴侣动物(猫、狗和马)或甚至用于人的疫苗产品)中更纯化的疫苗抗原相比，情况尤其如此。或者，特定的保护性抗原可能不为人所知，因此粗抗原制剂是包含必要抗原的唯一方法。因此，用于农业的非活体细菌、寄生虫或病毒疫苗通常包含少量纯化抗原，这些抗原源自例如灭活的细菌、寄生虫或病毒培养物，或源自此类培养物的提取物或级分。这种相当粗制的抗原可以基于灭活的细菌或寄生虫或灭活的病毒，可能经过一次清洗或浓缩；或基于细菌、寄生虫或病毒级分的抗原，例如裂解或破坏的细菌细胞、寄生虫或病毒。因此，这些粗制抗原制剂可能含有未定义或非预期的杂质，这些杂质可能会影响(组合)疫苗的安全性、有效性或稳定性。这就是为什么疫苗作为其开发过程的一部分，必须经过严格的安全性、有效性和稳定性测试，然后才能获得政府或监管机构的营销授权，将此类疫苗作为商业产品投放市场。非活抗原制剂中的未指定成分不一定是不需要的，因为它们可以充当其他佐剂，从而为免疫反应提供非特异性增强。此外，在制备非活细菌、寄生虫或病毒抗原的过程中，预计潜在的生物干扰因素将被灭活。然而，在开发包含粗抗原制剂的乳剂型疫苗的过程中，可以观察到对疫苗安全性、有效性或稳定性的不良影响。在制造佐剂疫苗时要克服的另一个障碍是防止各种疫苗成分之间的相互作用，这种相互作用会对免疫反应或疫苗的安全性或稳定性产生负面影响。这种相互作用可能发生在抗原本身之间，例如因为有些是相当粗糙的产品。此外，佐剂可能会干扰甚至破坏疫苗抗原。因此，很难开发一种能诱导针对一种或多种抗原的有效免疫反应的佐剂疫苗，尤其是对于与多种病原体抗原相关的复杂组合。此外，佐剂疫苗在动物身上使用时应是安全的，即不会产生明显的副作用，如发烧、局部肿胀、食欲不振等。此外，还有更实用的特性：理想情况下，乳剂疫苗应能够经济地生产，在配制和储存过程中足够稳定，并允许在存在其他抗原的情况下对每种抗原进行效力测试。从幼年起影响猪的一些最突出的疾病是由细菌引起的，例如：肺炎支原体和细胞内劳森氏菌；以及由病毒引起的，例如猪圆环病毒2型(pcv2)和猪生殖与呼吸综合征病毒(prrsv)。猪肺炎支原体(mhyo)是导致(猪)地方性肺炎的主要病原体，这是一种全球范围内发生的猪慢性呼吸道疾病。尤其是幼猪仔容易感染这种高度传染性的疾病。这种细菌相对较小，没有细胞壁，属于柔膜菌属。这些细菌以寄生方式寄生在宿主细胞上或细胞内。由mhyo引起的肺部疾病主要是免疫介导的病理，导致合并性肺炎。这种细菌定植并破坏肺部纤毛上皮，导致纤毛活动丧失。根据饲养条件和环境压力，这种疾病最严重的后果是它容易导致猪呼吸系统的不同继发感染，例如由其他细菌和病毒病原体引起的感染。这导致了所谓的猪呼吸道疾病综合症(prdc)，表现出严重的肺部病变。除了给动物带来不适之外，地方性肺炎和prdc还会因生长率和饲料转化率下降以及兽医护理和抗生素使用成本增加而给养猪业造成重大经济损失。细胞内劳森氏菌可引起增生性肠病，也称为回肠炎，这是世界各地断奶后猪常见的肠道疾病。特征性病变是回肠肠隐窝中未成熟肠细胞的增生，这些细胞含有病原体细菌。从肠细胞中清除细菌可消除相关的增生性病变。通过在肠细胞中以及肠道巨噬细胞内观察1.5-2.5μm长的弧菌状细菌，可以确认组织学病变为劳森氏菌阳性。在临床或亚临床病例中可通过pcr检测细菌。临床病例通常出现在生长育肥期。l.intracellularis细菌是专性细胞内、非运动性革兰氏阴性杆菌，来自脱硫弧菌科。猪圆环病毒2型(pcv2)与幼猪断奶后多系统萎缩综合征(pmws)有关。临床症状和病理学于1996年发表，包括进行性萎缩、呼吸困难、呼吸急促，偶尔出现黄疸和黄疸。这种新病原体被称为pcv2，因为它不同于已知的pcv，后者是pk-15细胞的天然污染物。pcv2是圆环病毒属的非常小的无包膜病毒。它包含一个带有两个主要基因的环状单链dna基因组。orf2基因编码约233个氨基酸的病毒衣壳蛋白。重组表达的pcv2 orf2蛋白形成病毒样颗粒，其作为亚单位疫苗高度有效。猪生殖与呼吸综合征病毒(prrsv)于1987年首次报道，并在20世纪90年代初成为流行病。它是包含单链正义rna基因组的动脉炎病毒属的小型包膜rna病毒。该病毒因生殖障碍和生长迟缓而给养猪业造成重大损失。与mhyo一样，prrsv在多因素prdc中起着重要作用。临床症状是流产和死胎或木乃伊胎，以及耳朵和外阴发绀。在新生猪中，该病毒会引起呼吸窘迫，并且更容易患上继发性呼吸道感染，例如格拉泽氏病(由副猪嗜血杆菌引起)。然而，亚临床感染也很常见。该病毒变化很大：除了欧洲变种(1型)和北美变种(2型)外，现在还有第三种基因型：一种高致病性变种，于2000年在中国出现，目前在亚洲引起猪的严重疾病。存在针对这些病原体中的每一种的商业疫苗。为了限制动物的压力以及饲养员的成本和劳动力，一些猪疫苗已被制备成组合疫苗。wo 2018/115435描述了一种猪组合疫苗，其包含pcv2的非活抗原和活prrsv。该疫苗是水包油乳剂，其包含角鲨烷和维生素e醋酸酯。wo 2021/048338描述了一种用于保护猪免受pcv2和mhyo病原体感染的组合疫苗，其包含pcv2的非活免疫原和mhyo的非活免疫原。该疫苗是水包油乳剂，其包含角鲨烷、维生素e醋酸酯和二氧化硅。兽医疫苗学领域仍然对有效疫苗感兴趣，特别是对跨物种安全有效的有效疫苗。口蹄疫是全球偶蹄动物的一种高度传染性和破坏性的疾病，具有重大的经济影响。该病的特征是发烧、跛足、淋巴细胞减少以及口腔、舌头、鼻子、脚和乳头出现水泡病变，可通过抑制易感动物运动、屠宰受感染动物和接种疫苗来控制。在大多数国家，动物使用灭活全病毒疫苗进行免疫，以控制口蹄疫病毒(fmdv)的传播。然而，所使用的疫苗技术存在功效问题，特别是在细胞介导免疫方面。为了解决这些问题，目前正在开发替代疫苗，例如重组蛋白和肽疫苗、空衣壳疫苗和基因工程化灭活疫苗。已经研究了多种疫苗佐剂促进fmdv疫苗免疫反应的效力。这些佐剂包括矿物油、皂苷(quil-a)、toll样受体(tlr)配体、细胞因子、脂质体等(y.cao，2014，expert rev.vaccines，第13卷，第1377-1385页)。为了解决这个问题，目前致力于开发有效的疫苗，将保护性抗原的应用与寻找有效的佐剂相结合，以最大限度地提高免疫原性，从而实现所需的免疫反应。cao(同上)对口蹄疫疫苗的传统佐剂和目前正在开发的佐剂的作用机制和免疫刺激作用进行了综述。下面简要讨论了一些最有希望的方法。传统的口蹄疫灭活全病毒疫苗通常在水性al(oh)3和皂苷中配制，或在油基佐剂中配制。其中，基于al(oh)3/皂苷的疫苗不适合用于猪，因为它们对这种物种的保护效力较低。与之相反，基于montanide isa-206油佐剂(包含十八烯酸和脱水甘露醇酯的油性溶液的矿物油基佐剂)和灭活抗原的w/o/w乳剂疫苗是预防口蹄疫的首选，因为它们可用于保护所有易感物种，是紧急疫苗接种的理想选择。此外，油佐剂疫苗比al(oh)3佐剂疫苗产生更高、更持久的免疫反应。建议使用新开发的矿物油基佐剂montanide isa-201作为替代品，因为与isa-206相比，它似乎可以在牛中诱导更早、更高的中和抗体反应、更高的细胞免疫力和保护效力。口蹄疫疫苗的真正挑战是找到一种跨物种起作用的佐剂。对于反刍动物，大多数佐剂疫苗使用w/o乳剂，而对于猪，通常使用o/w乳剂。目前fmdv疫苗的黄金标准是基于montanide isa-206的w/o/w乳剂疫苗。然而，这只能为跨物种fmdv疫苗组合物问题提供部分而复杂的解决方案：作为“双重乳剂”，或者更准确地说：可逆乳剂，它们有几个缺点。一个重要的缺点是乳剂在32℃以上会逆转，这意味着疫苗应尽可能冷藏，并且应避免32℃或以上的温度。在无法始终保持“冷链”物流的国家，这可能是一个挑战。另一个使用缺点是，由于其成分，这种乳剂难以注射(注射性差)。另一个令人担忧的问题是配方对高抗原有效载荷的敏感性，这可能发生在含有多种fmdv抗原的疫苗中。虽然可能有必要覆盖现场传播的所有菌株，但据观察，这会破坏基于montanide isa-206乳剂的多价fmdv疫苗组合物。作为另一种选择，已经描述了由皂苷(例如quil-a)、胆固醇、磷脂和抗原组成的免疫刺激复合物(iscom)。研究表明，iscom能够引发高滴度持久抗体和强大的辅助和细胞毒性t淋巴细胞反应。iscom已被描述为fmd重组蛋白(vp1蛋白的c端的一半)疫苗的佐剂；研究发现，iscom中的重组蛋白与montanide isa-206的组合可以在豚鼠中实现早期保护滴度和更持久的免疫力；在iscom中配制的fmd疫苗是否会在目标物种中同样成功还有待观察。此外，这项技术相当昂贵。还评估了合成胞苷-磷酸-鸟苷(cpg)寡脱氧核苷酸(odn)对fmd疫苗的佐剂作用。研究表明，cpg odn与isa-206的组合可促进重组fmdv疫苗a7(包含多个b细胞和t细胞表位)在小鼠和牛中诱导强烈且持久的特异性抗体反应。然而，cpg与fmd灭活疫苗的组合并未促进保护作用(cao，同上)。(alves等，2009,pigs.clin.vaccine immunol.，第16卷，第1151-1157页)。鉴于上述情况，我们仍然需要口蹄疫疫苗佐剂，以诱导所需的免疫增强作用，如强效和持久的体液和细胞免疫，同时满足安全性、稳定性和易用性方面的一般要求，以克服目前口蹄疫乳剂疫苗中可用佐剂的缺点。然而，由于疫苗开发是一个高度经验性的过程，需要不同类型的反应来预防口蹄疫，因此几乎没有理由断定某种佐剂会比其他可用替代品更有用(cao，上文，第1381页，右栏)。鉴于上述情况，兽医疫苗学领域仍然需要提供负担得起的方法和材料，以配制包含细菌、寄生虫和/或病毒抗原的安全、稳定和有效的佐剂疫苗。因此，本发明的目的是克服现有技术中的缺点，并通过提供可用作有效疫苗的稳定的细菌、寄生虫和/或病毒抗原佐剂乳剂来适应该领域的这种需求。背景技术：技术实现思路1、本发明提供了一种佐剂组合物，其包含水乳剂、生育酚或其药学上可接受的酯和作为乳化剂的聚乙氧基乙烯鲸蜡硬脂基醚。佐剂组合物可有利地用于配制乳剂疫苗。2、本发明还提供了一种包含所述佐剂组合物和抗原的疫苗组合物。3、本发明还提供了一种用于制备包含所要求保护的佐剂组合物和抗原的疫苗组合物的方法，其包括以下步骤：4、a)制备包含抗原的水相，和5、b)将所述水相与所要求保护的佐剂组合物混合。6、此外，本发明提供了所要求保护的疫苗组合物，其用于保护人或动物目标免受病原体引起的感染和/或疾病的方法中。7、下面将描述根据本发明所述的佐剂组合物和用其配制的疫苗组合物的细节和偏好。8、图例9、图1：10、样品ip.1(水相中的eumulgin)在t＝0(图1a)、37℃下10天后(图1b)和37℃下3周后(图1c)的显微镜视图。11、样品ip.2(油相中的eumulgin)在t＝0(图1d)、37℃下10天后(图1e)和37℃下3周后(图1f)的显微镜视图。12、样品ip.3(水相中的聚山梨酯80)在t＝0(图1g)、37℃下10天后(图1h)和37℃下3周后(图1i)的显微镜视图。13、图2：14、使用asia1/shamir svea-e/fmdv疫苗组合物对牛进行疫苗接种，发现病毒中和滴度较高(图2a)，并且还提供了针对fmdv攻击感染的完全保护(图2b)。详情见实施例8。15、图3：16、使用svea-e佐剂fmd疫苗组合物与o/tur/5/2009抗原作为初免和加强接种在牛中进行免疫研究的持续时间，并与相应的montanide isa206佐剂疫苗组合物进行比较。17、图4：18、使用svea-e佐剂fmd疫苗组合物与o/tur/5/2009抗原作为单次免疫接种在猪中进行免疫研究的持续时间，并与相应的montanide isa206佐剂疫苗组合物进行比较。19、图5：20、使用svea-e佐剂fmd疫苗组合物与o/tur/5/2009抗原作为单次免疫接种在山羊中进行免疫研究的持续时间，并与相应的montanide isa206佐剂疫苗组合物进行比较。21、图6：22、fmdv衣壳当包含在用svea-e佐剂配制的疫苗组合物中时在4℃下随时间变化的稳定性测试。详情见实施例8。23、图7：24、实施例4中每个样品ip.1、ip.2和ip.3(从上到下)的粒度分析仪(mastersizer)结果的图形表示，在37℃下10天后测量。