一种蚕丝蛋白原位成型水凝胶及其制备方法和应

本发明属于生物医药材料，具体涉及一种蚕丝蛋白原位成型水凝胶及其制备方法和应用。背景技术：1、溃疡性结肠炎(ulcerative colitis,uc)是一种以肠损伤出血和严重炎症反应为主要临床表现,具有多种诱因的炎症性疾病，在全球范围内影响超过350万人。在过去十年中，uc的患病率急剧上升，是全球一大公共卫生问题。uc的主要症状包括腹痛、腹泻、便血、黏液排泄和体重下降等。这些症状对患者的生活质量和工作能力造成了严重影响。目前，uc的治疗方法主要包括抗炎药物、免疫抑制剂和生物制剂等，这些治疗方法在一些患者中取得了一定的疗效，但仍存在一些挑战和限制。一方面，部分患者对现有治疗方法不敏感或出现耐药性，导致治疗效果不佳。另一方面，长期使用这些药物可能会引起副作用，如免疫抑制剂可能导致免疫功能低下，生物制剂可能引起过敏反应。因此，寻找一种更有效、安全的治疗方法对于改善uc患者的病情至关重要。2、肠损伤出血与严重炎症反应是两种相互关联的病理过程。肠道出血指的是肠道内黏膜层受到破坏后血管受损，血液渗漏。严重炎症反应是机体对肠黏膜损伤的非特异性免疫反应，包括炎症介质的释放、血管扩张、细胞浸润和组织损伤。严重炎症反应会导致肠黏膜肿胀、疼痛、溃疡形成和组织坏死等病理变化。这些病理过程相互影响，出血可能进一步加重炎症反应，而严重的炎症反应可能导致黏膜屏障的破坏和出血。肠黏膜是一个高度复杂的生理环境，黏膜屏障的修复和再生过程受到多种细胞、信号通路和分子的调控。这种复杂性使得治疗过程变得困难，因为干预一个环节可能无法完全修复整个黏膜屏障的功能。此外，肠道是一种高度动态的器官，不断受到食物、菌群和其他外界因素的影响。因此，治疗肠损伤出血与严重炎症反应时，难以将其从整体肠道环境中剥离出来进行干预。3、近年来，研究人员正在探索多种方法来研发新的治疗肠道出血和减轻炎症反应的材料。例如，通过纳米技术可以制备纳米粒子、纳米纤维或纳米涂层，用于控制药物的释放和增加其在结肠内的作用时间。其他研究方向包括利用干细胞治疗、基因治疗和肠道菌群调节等，以改善肠道的免疫环境和修复组织损伤。但是将药物有效递送到肠道内的目标位置是一个挑战。uc患者的肠黏膜可能存在溃疡、炎症和黏液层增厚等问题，这些因素限制了药物在肠道内的吸收和作用。其次，uc是一种慢性疾病，需要长期的治疗和管理。然而，当前的治疗材料往往难以提供持久的疗效，可能需要频繁使用或调整剂量，这给患者带来了不便。许多新的治疗uc的材料尚未经过充分的临床验证，缺乏大规模的临床试验数据和长期的观察结果。这使得这些材料在临床上的应用受到限制，难以成为标准治疗的选择。虽然研发新的治疗uc的材料具有重要意义，但目前仍存在一些挑战和不足。技术实现思路1、为了解决现有技术中的问题，提供更有效、针对性更强的治疗选择，改善uc患者的生活质量，本发明基于沙堡蠕虫建造避难所原理，设计了一种新型口服式原位成型水凝胶递送平台，以肠道的收缩蠕动作为前进动力，炎症部位特异性高表达的基质金属蛋白酶(mmps)为触发因子。当暴露在炎症环境中时，水不混溶的水凝胶前驱液可以在蠕动收缩下取代损伤肠表面的水分子，与uc区域的mmps发生反应，交联形成水凝胶牢固地粘附在损伤部位。由于肠道蠕动和炎症环境的协同作用，这种沙堡蠕虫激发的水凝胶有望实现高效的靶向粘附，在治疗uc引起的出血和严重炎症反应的临床应用中具有重要前景。2、本发明解决其技术问题是采用以下技术方案实现的：3、本发明目的在于提供一种蚕丝蛋白原位成型水凝胶，包括改性丝素蛋白和炎症响应性纳米粒子，改性丝素蛋白为采用含邻苯二酚基团的化合物改性的丝素蛋白，炎症响应性纳米粒子包括脂质混合物和介孔二氧化硅，介孔二氧化硅以fe3+为核心。4、含邻苯二酚基团的化合物包括多巴胺、左旋多巴、槲皮素、阿朴吗啡、鞣花酸、单宁酸等等。5、进一步的，优选的，含邻苯二酚基团的化合物采用多巴胺，丝素蛋白溶液中多巴胺浓度为25mm，50mm，100mm或200mm。6、本发明通过改变多巴胺的浓度制备了不同种类的丝素多巴胺，即改性丝素蛋白，丝素蛋白溶液中多巴胺浓度为25mm，50mm，100mm，200mm分别命名为丝素多巴胺-1,丝素多巴胺-2丝素多巴胺-3,丝素多巴胺-4。本发明方法中，多巴胺的优选浓度为50mm，即丝素多巴胺2。7、研究发现，多巴胺改性丝素蛋白时，多巴胺的投入量对水凝胶前驱液的凝胶时间有直接影响。多巴胺的投入量较高时，邻苯二酚浓度上升，前驱液的粘性增加，需要消耗大量fe3+才能交联形成水凝胶；多巴胺的投入量较低时，邻苯二酚结构较少，粘性较低，对fe3+灵敏可快速凝胶化，有利于后期响应mmps快速原位形成水凝胶。优选的，多巴胺投入量为50mm的丝素多巴胺，即丝素多巴胺-2。8、进一步的，脂质混合物的物质的量为200μmol、400μmol、800μmol或1600μmol。9、改变脂质混合物的物质的量以获得包封和释放fe3+最高效率的炎症响应性纳米粒子，获得凝胶速度和粘附效率最优的原位成型水凝胶。脂质混合物中，不同物质的量的脂质混合物(200μmol、400μmol、800μmol和1600μmol)对炎症响应性纳米粒子中的fe3+的包封和释放效率有直接影响。当脂质混合物的物质的量较高时，fe3+的包封效率会大大提高，包膜厚度的提高会影响fe3+的释放效率；当脂质混合物的物质的量较低时，fe3+的包封效率较低。因此，为保证fe3+有足够多的量得到有效释放，我们选择较高物质的量(800μmol)的脂质混合物。10、进一步的，脂质混合物包括质量百分比为75％:15％:10％的抗坏血酸棕榈酸酯：胆固醇：磷酸二辛酯。11、进一步的，炎症响应性纳米粒子质量与改性丝素蛋白体积比值为1：50-400。12、调控炎症响应性纳米粒子与改性丝素蛋白的复合比例，获得凝胶速度和粘附效率最优的原位成型水凝胶，炎症响应性纳米粒子与改性丝素蛋白自组装时炎症响应性纳米粒子的质量对原位成型水凝胶的性能有重要影响。炎症响应性纳米粒子质量与改性丝素蛋白体积比值为1：400记为原位成型水凝胶-1，1:200记为原位成型水凝胶-2，1:100记为原位成型水凝胶-3,1:50记为原位成型水凝胶-4。炎症响应性纳米粒子与改性丝素蛋白之间有氢键作用，形成的原位成型水凝胶可稳定存在。当炎症响应性纳米粒子的质量较低时，原位成型水凝胶-1，-2的粘稠度较低，具有较好的流动性，但fe3+释放的浓度较低导致原位凝胶化的速度较慢；当炎症响应性纳米粒子的质量较高时，原位成型水凝胶-3，-4的粘稠度较高，但原位成型水凝胶-4的流动性较差。因此，选用具有较高粘稠度与快速凝胶化的原位成型水凝胶-3。13、本发明的原位成型水凝胶，包括富含多巴胺的蚕丝纤维蛋白基质和含有介孔二氧化硅的炎症响应纳米粒子，介孔二氧化硅以fe3+为核心，抗坏血酸棕榈酸酯为外壳。水凝胶前驱液通过富含多巴的丝素蛋白基质和炎症反应性纳米颗粒之间的氢键形成致密流体，使其在正常肠液中保持稳定和水不混溶，并可通过肠道蠕动向前驱动。14、当暴露在炎症环境中时，水不混溶的前驱液可以在蠕动收缩下取代损伤肠表面的水分子，使炎症反应的纳米颗粒与uc区域的mmps发生反应，使富含多巴胺的丝素蛋白与损伤组织表面进一步交联，形成牢固的粘附，从而快速阻止肠道出血并持续提供治疗减轻炎症反应。15、一种蚕丝蛋白原位成型水凝胶的制备方法，包括以下步骤：16、步骤a)：改性丝素蛋白：将蚕茧加入到na2co3溶液中脱去丝胶，libr溶液溶解蚕丝蛋白后，透析获得丝素蛋白溶液，加入含邻苯二酚基团的化合物，再加入naoh水溶液，将溶液调至碱性，得到改性丝素蛋白；17、步骤b)：制备炎症响应性纳米粒子：将富含抗坏血酸棕榈酸酯的脂质混合物溶解在有机溶剂中，蒸干形成薄膜后加入介孔二氧化硅与氯化铁的混合溶液，继续蒸干后分散在pbs缓冲液中，冷冻干燥得到炎症响应性纳米粒子；18、步骤c)：改性丝素蛋白与炎症响应性纳米粒子的自组装：将制备的炎症响应性纳米粒子快速加入到涡旋中的改性丝素蛋白自组装得到原位成型水凝胶。19、进一步的，多巴胺改性丝素蛋白的方法包括以下步骤称取na2co3和蚕茧添加至去离子水中，水浴1h；使用去离子水清洗已脱胶的蚕茧三次，60℃烘箱中烘干12h；将烘干的蚕丝加入libr溶液中，60℃下水浴4h；得到的丝素蛋白溶液封装在分子量为3500的透析袋中，使用去离子水透析，每6h更换一次去离子水；透析至第3天改用聚乙二醇-20000溶液反渗透直至丝素蛋白溶液为9％w；取丝素蛋白溶液，添加盐酸多巴胺后将溶液ph调制8.5，在4℃冰箱静置48h以聚合形成丝素多巴胺。20、进一步的，制备炎症响应性纳米粒子的方法包括将脂质混合物溶解在氯仿：甲醇为9:1的有机溶剂中；然后转移至圆底烧瓶，55℃下旋转蒸发，直至脂质混合物在烧瓶上形成一层薄膜；将介孔二氧化硅与fecl3溶液共混超声，然后添加到上述圆底烧瓶中与薄膜水合，继续在55℃下旋转蒸发直至圆底烧瓶中的溶液全部转化为薄膜；将获得的薄膜使用pbs超声分散，离心清洗三次收集产物，冷冻干燥48h以得到炎症响应性纳米粒子。21、进一步的，改性丝素蛋白与炎症响应性纳米粒子的自组装方法包括将改性丝素蛋白以1500rpm涡旋，然后快速加入炎症响应性纳米粒子，继续涡旋10min，自组装得到原位成型水凝胶。22、一种蚕丝蛋白原位成型水凝胶在制备溃疡性结肠炎的缓释药物中的应用，缓释药物为口服制剂。23、与现有技术相比，本发明的有益技术效果在于：24、1、针对常规肠道止血药物在肠道中靶向效率低和停留时间短的缺陷，本发明借鉴沙堡虫，提出了一种炎症响应型原位成型水凝胶，以实现对肠道损伤部位的有效靶向粘附，从而达到止血和促进愈合的目的。25、2、本发明通过三个步骤制备新型肠道止血材料——口服式原位成型水凝胶，首先使用多巴胺改性丝素蛋白作为前驱液基质，这一程序包括调节多巴胺的浓度与溶液ph触发聚合；其次通过薄膜水合法将抗坏血酸棕榈酸酯组装到吸附有fe3+的介孔二氧化硅表面，这一程序包括调节脂质混合物的物质的量以优化fe3+的负载率和释放率；最后，炎症响应性纳米粒子与丝素多巴胺自组装，这一程序包括调节炎症响应性纳米粒子的质量使原位成型水凝胶具有较好的流动性与快速响应性凝胶化。26、3、本发明的原位成型水凝胶暴露在炎症环境中时，在蠕动收缩作用下，不溶于水的凝聚层可以将损伤肠道表面的水分子置换出来，从而使炎症反应纳米粒子与uc区域的mmps发生反应，使富含多巴的蚕丝纤维蛋白与损伤组织表面进一步交联，形成牢固的粘附。27、4、本发明口服式原位成型水凝胶主要由富含多巴胺的蚕丝纤维蛋白基质和含有介孔二氧化硅的炎症响应纳米粒子组成，介孔二氧化硅以fe3+为核心，抗坏血酸棕榈酸酯为外壳。其富含氨基和邻苯二酚，具有抗氧化性、优异粘附性及良好的生物相容性，在肠道蠕动推进过程中具有稳定的物理结构，在炎症部位mmps的刺激下，达到原位凝胶化的效果，以充分发挥氨基和酚羟基的凝血和促愈功能；同时，fe3+的释放可以促进凝血级联反应，加速血栓形成。28、5、本发明制备的介孔二氧化硅具有球型的外观形貌，直径在120-150nm，在负载fe3+及使用抗坏血酸棕榈酸酯包覆后，炎症响应性纳米粒子的形貌与纯介孔二氧化硅相比没有发生明显的变化，直径变大为150-190nm；炎症响应性纳米粒子与丝素多巴胺自组装后，丝素多巴胺的孔径明显减小，与响应性纳米粒子紧密结合。元素分析发现炎症响应性纳米粒子表面均匀分布着c、n和o元素，内部分布着fe元素，证明了本发明炎症响应性纳米粒子的成功制备。29、6、本发明的原位成型水凝胶可以在肠液中保持稳定，静置12h也不与肠液混溶，在含有mmps的肠液中可以快速原位形成水凝胶，形成的水凝胶具有优异的粘附力，在牵拉中形成纤维细丝。本发明的原位成型水凝胶在肠道收缩下与炎症部位充分接触，响应mmps快速形成水凝胶稳固粘附伤口，富含的氨基和酚羟基可以聚集红细胞与血小板、收缩血管以促进凝血，释放的fe3+还能够促进凝血级联反应，加速血栓形成。此外，水凝胶可以调节氧化应激和保护伤口免受微生物侵害，从而加速愈合。30、上述说明仅是本发明技术方案的概述，为了能够更清楚了解本发明的技术手段，而可依照说明书的内容予以实施，并且为了让本发明的上述内容和其目的、特征和优点能够更明显易懂，以下特举本发明的具体实施方式。