用于治疗脂代谢异常疾病的核酸-脂质纳米颗粒复

本发明涉及生物，特别涉及一种核酸-脂质纳米颗粒复合物及其制备方法与应用。背景技术：1、脂质代谢异常是指先天性或获得性因素造成的血液及其他组织器官中脂质(脂类)及其代谢产物质和量的异常。脂质在体内的主要功用是氧化供能，脂肪组织是机体的能量仓库，脂肪也能协同皮肤、骨骼、肌肉保护内脏，防止体温散发和帮助食物中的脂溶性维生素的吸收。脂类代谢异常时，可产生一系列的疾病，如高脂蛋白血症、脂质贮积病及其造成的临床综合征、肥胖症、酮症酸中毒、脂肪肝和新生儿硬肿症等。2、脂质代谢异常最直接的结果是超重和肥胖。由于目前使用的他汀类药物和贝特类药物需要持续用药及其可能带来的严重的不良后果，基因疗法有望为脂质代谢异常疾病提供更有针对性的治疗方法。3、与直接重组蛋白给药等传统方法相比，mrna疗法通过促进体内快速蛋白质生产，在应用方面具有较多明显的优势。根据中心法则，mrna通过翻译产生相应的蛋白质，进而发挥生物学功能。在这个过程中mrna是遗传物质从dna传递到蛋白质的中间载体。由于mrna处于蛋白质的“上游”，从理论上讲，mrna可以对所有蛋白层面的药物进行替代。从制药行业的角度来看，mrna是一种非常有潜力的候选药物，可以满足基因治疗、癌症治疗以及开发疫苗等需求，而且其整体工艺简单，研发速度快，稳定性高。因此，mrna药物作为新兴的药物形式，已成为药物研发领域的研究热点。4、因此，亟需开发一种新的有效的用于脂代谢异常的核酸-脂质纳米颗粒复合物。技术实现思路1、本发明目的是提供一种用于脂代谢异常的核酸-脂质纳米颗粒复合物，优化后的mrna序列提高了其结构紧密性、转录稳定性及翻译效率，从而提高了mrna编码蛋白的表达量，并与脂质体制备成复合物用于治疗以脂肪肝为代表的脂代谢异常疾病。2、为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：3、在本发明的第一方面，提供了一种用于脂代谢异常的核酸-脂质纳米颗粒复合物，所述核酸-脂质纳米颗粒复合物包括：表达cct蛋白的核酸和脂质纳米颗粒；4、进一步地，所述表达cct蛋白的核酸包括传统单链mrna、自复制mrna、环状rna或dna质粒中的一种。5、进一步地，所述表达cct蛋白具有如seq id no.1-seq id no.8所示的氨基酸序列。其中，seq id no.1-seq id no.4分别为小鼠、人、金黄地鼠及恒河猴的全长氨基酸序列；seq id no.5-seq id no.8分别为小鼠、人、金黄地鼠及恒河猴的变体氨基酸序列。6、进一步地，所述表达cct蛋白的mrna的开放阅读框含有如seq id no.9-seq idno.21所示的核苷酸序列。其中，seq id no.9为野生型核苷酸序列，seq id no.10-seq idno.16是对cct蛋白经密码子优化后的核苷酸序列，seq id no.17-seq id no.21是对cct变体蛋白经密码子优化后的核苷酸序列。7、开放阅读框(orf)是一段连续的dna或rna，以起始密码子开始并以终止密码子结束。orf通常编码蛋白质。应当理解，本文公开的序列还可包含额外的元件，例如，5’和3’utr，但与orf不同，这些元件不一定存在于本公开的rna多核苷酸中。8、进一步地，所述表达cct蛋白的核酸的所述单链mrna自5’端依次包括5’帽子结构、5’非编码区、cct蛋白编码区、3’非编码区和多聚腺苷酸尾，其中，与野生型cct蛋白的mrna核苷酸序列相比，所述表达cct蛋白的优化的mrna的所述5’帽子结构替换为cap ag结构或cap au结构或cap gg结构；所述5’utr选自seq id no：22-seq id no：24中的一条；所述cct蛋白编码区的核苷酸序列选自seq id no：9-seq id no：21所示；所述3’utr的核苷酸序列选自seq id no：25-seq id no：27所示；所述多聚腺苷酸尾的a的个数为10-300(优选为60-240)。9、在一些实施方案中，组合物包括具有编码cct蛋白的开放阅读框、至少一个5’末端帽的rna多核苷酸，并且配制在脂质纳米颗粒内。多核苷酸的5’-加帽可在体外转录反应期间使用以下化学rna帽类似物同时完成，以产生5’-鸟苷帽结构：cap ag、cap au、cap gg。10、进一步地，3’-多聚(a)尾通常是添加至转录的mrna的3’端的一段腺嘌呤核苷酸。在一些情况下，其可包含高达约400个腺嘌呤核苷酸。在一些实施方案中，3’-多聚(a)尾的长度对于mrna的稳定性可为必需的要素。11、在一些实施方案中，对编码本公开的抗原的orf进行密码子优化。密码子优化工具、算法和服务是本领域中已知的-非限制性实例。在一些实施方案中，使用优化算法优化orf序列。12、在一些实施方案中，核酸中经修饰的核碱基包含1-甲基-假尿苷(m1ψ)、1-乙基-假尿苷(e1ψ)、5-甲氧基-尿苷(mo5u)、5-甲基-胞苷(m5c)和/或假尿苷(ψ)。在一些实施方案中，核酸中的经修饰的核碱基包含5-甲氧基甲基尿苷、5-甲硫基尿苷、1-甲氧基甲基假尿苷、5-甲基胞苷和/或5-甲氧基胞苷。在一些实施方案中，多核糖核苷酸包括至少两种任何上文所提及的经修饰的核碱基的组合，包括但不限于化学修饰。13、本公开的mrna可包含一个或多个充当或用作非翻译区的部分。在一些实施方案中，本公开的5’utr包含选自seq id no：22-seq id no：24的序列。本发明公开的3条序列是经过密码子优化的序列。在其他实施方式中还可以采用其他5’utr。14、在本公开的一些实施方案中，3’utr是mrna的在终止密码子正下游(3’)的区。本公开的3’utr包含选自seq id no：25-seq id no：27的序列。本发明公开的3条序列中包含调节元件，并进行了密码子优化。在其他实施方式中还可以采用其他3’utr。15、在本公开的一些实施方案中，多聚(a)尾可含有10至300个单磷酸腺苷。例如，多聚(a)尾可含有10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、210、220、230、240、250、260、270、280、290或300个单磷酸腺苷。在一些实施方案中，多聚(a)尾含有50至250个单磷酸腺苷。16、进一步地，所述脂质体包含可电离脂质，非阳离子脂质，胆固醇和peg修饰的脂质。本公开的脂质纳米颗粒可使用本领域中通常已知的组分、组合物和方法产生。17、在一些实施方案中，所述脂质纳米颗粒包含摩尔比率为20-60％的可电离阳离子脂质。例如，所述脂质纳米颗粒可包含摩尔比率为20-50％、20-40％、20-30％、30-60％、30-50％、30-40％、40-60％、40-50％或50-60％的可电离阳离子脂质。在一些实施方案中，所述脂质纳米颗粒包含摩尔比率为20％、30％、40％、50％或60％的可电离阳离子脂质。18、在一些实施方案中，所述脂质纳米颗粒包含摩尔比率为5-25％的非阳离子脂质。例如，所述脂质纳米颗粒可包含摩尔比率为5-20％、5-15％、5-10％、10-25％、10-20％、10-25％、15-25％、15-20％或20-25％的非阳离子脂质。在一些实施方案中，所述脂质纳米颗粒包含摩尔比率为5％、10％、15％、20％或25％的非阳离子脂质。19、在一些实施方案中，所述脂质纳米颗粒包含摩尔比率为25-55％的固醇。例如，所述脂质纳米颗粒可包含摩尔比率为25-50％、25-45％、25-40％、25-35％、25-30％、30-55％、30-50％、30-45％、30-40％、30-35％、35-55％、35-50％、35-45％、35-40％、40-55％、40-50％、40-45％、45-55％、45-50％或50-55％的固醇。在一些实施方案中，所述脂质纳米颗粒包含摩尔比率为25％、30％、35％、40％、45％、50％或55％的固醇。20、在一些实施方案中，所述脂质纳米颗粒包含摩尔比率为0.5-15％的peg修饰的脂质。例如，所述脂质纳米颗粒可包含摩尔比率为0.5-10％、0.5-5％、1-15％、1-10％、1-5％、2-15％、2-10％、2-5％、5-15％、5-10％或10-15％。在一些实施方案中，所述脂质纳米颗粒包含摩尔比率为0.5％、1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％或15％的peg修饰的脂质。21、在一些实施方案中，所述脂质纳米颗粒包含摩尔比率为20-60％的可电离阳离子脂质、5-25％的非阳离子脂质、25-55％的固醇和0.5-15％的peg修饰的脂质。22、在一些实施方案中，所述可电离脂质、非阳离子脂质、胆固醇和peg修饰的脂质的摩尔比为50:10:38.5:1.5。23、进一步地，所述可电离脂质选自dlin-kc2-dma、dlin-mc3-dma或l319中的一种；优选地，所述可电离脂质为dlin-mc3-dma。24、进一步地，所述非阳离子脂质选自1，2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(dspc)、1，2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(dope)、1，2-二亚油酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(dlpc)、1，2-二肉豆蔻酰基-sn-甘油-磷酸胆碱(dmpc)、1，2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(dopc)、1，2-二棕榈酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(dppc)、1，2-二-十一烷酰基-sn-甘油-磷酸胆碱(dupc)、1-棕榈酰基-2-油酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(popc)、1，2-二-o-十八碳烯基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(18∶0二醚pc)、1-油酰基-2胆固醇基半琥珀酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(ochemspc)、1-十六烷基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(c16 lyso pc)、1，2-二亚麻酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱、1，2-二花生四烯酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱、1，2-二-二十二碳六烯酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱、1，2-二植烷酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(me16.0pe)、1，2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺、1，2-二亚油酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺、1，2-二亚麻酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺、1，2-二花生四烯酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺、1，2-二-二十二碳六烯酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺、1，2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸-外消旋-(1-甘油)钠盐(dopg)、鞘磷脂和其混合物中的一种；优选地，所述非阳离子脂质为popc。25、进一步地，在一些实施方案中，本公开的peg修饰的脂质包含peg修饰的磷脂酰乙醇胺、peg修饰的磷脂酸、peg修饰的神经酰胺、peg修饰的二烷基胺、peg修饰的二酰基甘油、peg修饰的二烷基甘油和其混合物。在一些实施方案中，所述peg修饰的脂质选自1,2-二肉豆蔻酰基-sn-甘油-3-甲氧基聚乙二醇(dmg-peg2000)。所述peg修饰的脂质的分子量为500-5000。26、在一些实施方案中，本公开的固醇包含胆固醇、粪固醇、谷固醇、麦角固醇、菜油固醇、豆固醇、菜籽固醇、番茄碱、熊果酸、α-生育酚和其混合物。27、在一些实施方案中，本公开的lnp包含约2∶1至约30∶1的n∶p比。优选地，本公开的lnp包含约6∶1的n∶p比。28、进一步地，所述脂质纳米颗粒尺寸为50-200nm。29、进一步地，所述脂质纳米颗粒包封核酸的包封率为80～99％。30、作为一种具体的实施方式，所述脂质体包含dlin-mc3-dma、popc、胆固醇和dmg-peg2000，摩尔比为50:10:38.5:1.5。本发明通过特定磷脂的配方组合，进一步提高lnp对于治疗剂的肝实质细胞靶向递送效率，提高治疗剂的预防和治疗效果。31、作为一种具体的实施方式，提供了一种用于脂代谢异常的核酸-脂质纳米颗粒复合物，所述核酸-脂质纳米颗粒复合物包括：表达cct蛋白的核酸和脂质纳米颗粒；所述表达cct蛋白的mrna的核苷酸序列如seq id no.9-seq id no.21所示(更为优选地核苷酸序列如seq id no.10所示)，所述脂质体包含dlin-mc3-dma、popc、胆固醇和dmg-peg2000，摩尔比为50:10:38.5:1.5。32、本发明提供的优化的肝细胞靶向的脂质纳米颗粒popc-lnp与商业化的脂质纳米颗粒dspc-lnp相比，靶向肝脏的效率dspc-lnp的3.96倍；并且靶向肝细胞递送效率是dspc-lnp的2.49倍。33、在本发明的第二方面，提供了一种用于脂代谢异常的核酸-脂质纳米颗粒复合物的制备方法，所述制备方法包括：34、获得表达cct蛋白的核酸；35、将所述表达cct蛋白的核酸包裹进入脂质纳米颗粒内，得到核酸-脂质纳米颗粒复合物。36、作为一种优选的实施方式，所述获得表达cct蛋白的核酸包括：37、利用线性化的质粒dna为模板，在体外进行酶转录反应合成，获得所述的表达cct蛋白的优化的mrna。38、在本发明的第三方面，提供了所述的用于脂代谢异常的核酸-脂质纳米颗粒复合物在制备用于预防、治疗、和/或改善选自糖尿病，糖尿病性肾病，脂肪肝，非酒精性脂肪肝炎，糖尿病伤口愈合，肝硬化、甲状腺功能减退症、肝肾疾病、糖原贮积症、系统性红斑狼疮、骨髓瘤、脂肪萎缩症、急性卟啉病、高血脂症、高脂蛋白血症、高密度脂蛋白减少症和家族性高胆固醇血症中的一种的药物的用途。39、本发明实施例中的一个或多个技术方案，至少具有如下技术效果或优点：40、本发明提供的核酸-脂质纳米颗粒复合物及其制备方法与应用，本发明的改造后的cct蛋白比天然序列的cct蛋白更稳定、表达量显著更高。核酸-脂质纳米颗粒复合物治疗之后，降低并维持小鼠肝脏甘油三酯水平，降低高脂饮食(hfd)饲养的非酒精性脂肪肝病(nafl)小鼠及胆碱蛋氨酸缺乏饮食(mcd)饲养的非酒精性脂肪肝炎(nash)小鼠模型肝脏的炎症水平，并恢复肝脏或血液中游离脂肪酸、甘油三酯到正常水平，这表明这种新型的核酸-脂质纳米颗粒复合物在体内递送核酸治疗制剂方面有潜在应用价值。