一种放射性核素铁蛋白诊疗探针的构建方法及其

本发明涉及纳米技术、生物医药和放射医学，更具体地说，它涉及一种放射性核素铁蛋白诊疗探针的构建方法及其应用。背景技术：1、铁蛋白是生物体内重要的铁储存和运输蛋白，由24个重链和轻链亚基按照一定比例构成，不同组织中的铁蛋白两种亚基比例存在差异。铁蛋白两种亚基可以按照任意比例自组装成外径为12 nm，内腔直径为8 nm的空心纳米笼。其中人重链铁蛋白（hfn）具有内在的肿瘤靶向特性，能够特异性结合肿瘤部位高表达的转铁蛋白受体1（tfr1）。铁蛋白与受体tfr1的结合存在阈值效应，只有受体高表达的肿瘤部位才能够高度结合铁蛋白并将其摄取，而其他正常组织受体表达量低，不会摄取铁蛋白，因此铁蛋白具有良好的生物安全性，目前已经被广泛用于抗癌药物和诊断分子的肿瘤靶向递送。2、铁蛋白作为药物载体具有多种优势。相对于其他药物载体，铁蛋白独特的自组装特性使得铁蛋白能够通过多种方式实现不同药物分子的高效荷载。基于铁蛋白的货物装载方式主要有三种：扩散法、基于ph/尿素的铁蛋白拆卸/重组方法和基于热响应通道的方法。采用不同的装载方式，已经实现了对多种小分子药物、治疗基因、成像剂和金属纳米粒子的高效递送。在生物安全性方面，铁蛋白作为人体内一种内源性蛋白，具有免疫原性低、生物相容性好、靶向特异性高和易降解等优势。另外，铁蛋白具有12 nm的粒径，能够在血液循环中，逃脱网状内皮系统的吞噬，具有较长的半衰期，同时可以利用增强渗透与滞留效应，增强药物在病变部位的积累。3、放射性核素是指自身能够自发产生α、β或γ射线的金属或非金属元素。利用放射核素释放的电离辐射，能够实现对疾病的治疗和诊断。目前，放射核素治疗策略分为靶向、介入和贴敷等三种方式，其中多肽和抗体偶联的放射性核素靶向治疗是公认为最具有潜力，也是效果最好的核素药物诊疗方式。该类药物将螯合有核素的螯合剂通过连接臂与多肽等靶向配体结合，在靶向配体的作用下，引导放射性核素到达靶标，使放射线集中破坏靶标组织，从而实现精准治疗，降低药物对正常组织的损害。然而，该类药物多肽部分在血液中会被蛋白酶快速降解，并且分子量小，易被肾脏清除，在体内的稳定性差，半衰期短 。4、人重链铁蛋白纳米笼含有72个带巯基的半胱酸，720个带羧基的氨基酸，504个带氨基的氨基酸以及240个带有咪唑基团的组氨酸，大量的氨基、羧基、巯基和咪唑基团为金属离子的稳定螯合提供丰富的位点。通过基因工程的手段可在铁蛋白内部空腔增加组氨酸标签和镧系元素结合标签，提高铁蛋白内部的核素螯合能力。因此，铁蛋白可以通过直接螯合策略实现对64cu，177lu和68ga等放射性核素的高效负载，依靠铁蛋白的天然靶向能力和优异的纳米尺寸，能够克服传统的靶向核素药物稳定性差、半衰期短的缺点，实现放射性核素药物的精准递送，提高放射性核素药物的治疗和诊断效果，具有广阔的应用前景。技术实现思路1、本发明的目的是提供一种放射性核素铁蛋白诊疗探针的构建方法及其应用，本发明所制备的放射性核素铁蛋白诊疗探针生物相容性好，可特异性地携带放射性同位素靶向到肿瘤部位，利用核素放射出不同形式的射线实现对肿瘤组织的精确定位和高效杀伤，具有良好的应用前景。2、本发明的上述技术目的是通过以下技术方案得以实现的：一种放射性核素铁蛋白诊疗探针，包括铁蛋白载体以及螯合在铁蛋白载体上的放射性核素，所述铁蛋白为天然提取或者通过基因工程制备，所述铁蛋白由24个重链亚基或轻链亚基任意比例自组装而成；3、所述放射性核素为68ga、64cu、67cu、223ra、188re、186re、89zr、177lu、90y、175yb、225ac、212bi、213bi、153sm、47sc、44sc、89sr、166ho、103pd、105rh、60co、99mtc、198au和169er中的一种或多种。4、作为优选，所述铁蛋白来源于基因工程制备的铁蛋白。5、作为优选，所述铁蛋白由24个人铁蛋白重链亚基自组装而成；6、作为优选，所述铁蛋白由24个末端带有组氨酸标签的人铁蛋白重链亚基自组装而成；7、作为优选，所述铁蛋白由24个末端带有镧系元素结合标签的人铁蛋白重链亚基自组装而成。8、作为优选，所述放射性核素为68ga、64cu、89sr、99mtc、153sm、 177lu和90y中的一种或多种。9、本发明还提供一种放射性核素铁蛋白诊疗探针的构建方法：包括以下步骤：10、s1.制备并纯化铁蛋白；11、s2.将放射性核素装载至铁蛋白纳米载体中；12、s3.配位数高的放射性核素负载至铁蛋白上之后，采用组氨酸交联法辅助交联，将放射性核素稳定交联在铁蛋白的纳米空腔中；13、s4.将游离的组氨酸和核素纯化除去。14、本发明进一步设置为：所述s1中制备并纯化铁蛋白的具体操作如下：15、（1）将含有铁蛋白基因的表达质粒转化入大肠杆菌；16、（2）37 ℃恒温下振荡培养，待细菌生长至对数生长期；17、（3）诱导蛋白表达，随后将菌液离心，收集菌体，超声破碎后，离心收集上清液；18、（4）将上清液置于60 ℃水浴热处理后再离心，收集上清液，采用硫酸铵沉淀法将铁蛋白析出，随后离心收集铁蛋白粗产物；19、（5）透析除去硫酸铵，之后使用阴离子交换色谱和疏水色谱进一步纯化，获得笼状铁蛋白。20、本发明进一步设置为：所述诱导蛋白表达的方法包括iptg、吲哚丙烯酸和阿拉伯糖的化学诱导方法和温度诱导方法。21、作为优选，所述诱导蛋白表达的方法为iptg诱导方法。22、本发明进一步设置为：所述放射性核素通过超声辅助螯合法、ph解聚/重组法或高温孵育法装载至铁蛋白载体上。23、本发明进一步设置为：所述超声辅助螯合法装载放射性核素于铁蛋白载体上的步骤如下：24、（1）放射性核素边超声边滴加至铁蛋白缓冲溶液中，超声频率为20-400 khz，随后搅拌孵育15 min-180 min；25、（2）去除未被装载的核素，纯化回收；26、所述纯化回收的方法包括离心、透析、疏水层析、超滤、凝胶过滤层析和离子交换层析中的一种或几种。27、本发明进一步设置为：所述ph解聚/重组法将放射性核素装载至铁蛋白载体上的步骤如下：28、（1）将铁蛋白缓冲溶液用盐酸溶液调节至ph<3.5；作为优选，所述ph调节至2-3之间；29、（2）向步骤（1）中的铁蛋白缓冲溶液中，滴加放射性核素孵育，混合液搅拌孵育15min-40 min；30、（3）用氢氧化钠溶液恢复ph至6-8，静置15 min-2 h，得到粗产物；作为优选，静置时间为2h；31、（4）去除未被装载的放射性核素，除掉聚集的铁蛋白，纯化回收得到分散性好、内部空腔装载有核素的铁蛋白，所述纯化的过程包括离心、透析、疏水层析、超滤、凝胶过滤层析和离子交换层析中的一种或几种。32、本发明进一步设置为：所述高温孵育法装载放射性核素至铁蛋白载体上的步骤如下：33、（1）铁蛋白缓冲溶液升温至60℃-72℃，将放射性核素滴加至铁蛋白缓冲溶液中，保持温度，孵育15 min-6 h；34、作为优选，铁蛋白缓冲溶液升温至60℃；35、作为优选，孵育时间为2h；36、（2）自然冷却恢复至室温，铁蛋白结构恢复，得到粗产物；37、（3）去除未被装载放射性核素，除掉聚集的铁蛋白，纯化回收得到装载有放射性核素的铁蛋白，所述纯化的过程包括离心、透析、疏水层析、超滤、凝胶过滤层析和离子交换层析中的一种或几种。38、本发明进一步设置为：所述组氨酸交联法包括如下步骤：39、（1）放射性核素螯合的铁蛋白缓冲溶液升温至60℃以上；温度优选为60℃；40、（2）组氨酸的缓冲溶液滴注到混合物中，滴注结束后静置2h；41、（3）自然恢复至室温，纯化除掉游离的放射性核素和组氨酸，所述纯化的过程包括高速离心、透析、疏水层析、超滤凝胶过滤层析和离子交换层析中的一种或两种。42、进一步，所述的放射性核素铁蛋白诊疗探针在制备治疗和诊断肺癌、乳腺癌、卵巢癌、黑色素瘤、结直肠癌、胃癌、胰腺癌、膀胱癌、宫颈癌、食道癌、甲状腺癌、肾癌、前列腺癌、脑癌以及各种造血系统癌试剂中的应用。43、综上所述，本发明具有以下有益效果：44、（1）本发明的放射性核素铁蛋白诊疗探针，具有制备方法简单 ，制备效率高的特点，能够进行快速的大规模生产，减少成本投入。45、（2）本发明中的放射性核素可以通过配位作用与铁蛋白氨基酸侧链上的活性基团进行配位，从而稳定结合在铁蛋白上。通过基因工程的方法可以调控铁蛋白纳米空腔的活性基团数量和位置，结合放射性核素与铁蛋白的孵育比例，可调节铁蛋白放射性核素载量的高低。配位反应时加入同核或异核放射性核素可以形成同核或异核粒子，从而可实现该铁蛋白负载一种或多种放射性核素的目的。该铁蛋白放射性核素载量大致为:0.05~100mci/mg铁蛋白。46、（3）本发明以铁蛋白作为放射性核素载体，赋予放射性核素优异的靶向性和长时间的体内驻留能力，提高了放射性核素的利用效率，同时铁蛋白具有良好的生物相容性，因此放射性核素铁蛋白诊疗探针具有临床应用价值。