一种囊泡在治疗自身免疫性眼病中的应用

本发明涉及生物医药，具体涉及一种囊泡在治疗自身免疫性眼病中的应用。背景技术：1、自身免疫性眼病是危害眼部健康的主要疾病，包括角膜炎、结膜炎、虹膜睫状体炎、自身免疫性葡萄膜炎、巩膜炎、视网膜脉络膜炎、增殖性玻璃体视网膜病变、糖尿病视网膜病变或老年性黄斑变性等多种疾病，其中，自身免疫性葡萄膜炎(au)是导致视力丧失的主要原因之一，临床往往表现为累及视网膜和(或)脉络膜的、慢性及复发性的炎症。患者的自身免疫耐受机制受到破坏，免疫系统针对自身抗原的异常激活导致机体产生抗体或免疫细胞攻击自身组织，从而产生视物模糊、畏光、流泪以及疼痛等多种不适症状。其迁延不愈常导致多种严重临床并发症，如并发性白内障，继发性青光眼，黄斑囊样水肿以及严重的视网膜损伤等。2、目前，自身免疫性眼病的治疗手段着眼于抑制炎症发展和减少不良反应。临床常见的药物包括糖皮质激素和免疫抑制剂，这些药物应用广，价格较为低廉。然而值得注意的是，传统治疗方法普遍存在局限性，长期使用会出现一系列问题，如白内障、青光眼以及系统性不良反应。一些新型药物，包括各种生物制剂如阿达木单抗，正逐渐被应用于临床，但其只针对单一细胞因子的特性也限制了其更广泛的应用。因此，寻求更有效、安全的新型治疗方案便成了当今的研究热点之一，以期在提高治疗效果的同时最小化治疗产生的风险和副作用。3、间充质干细胞(mscs)是一类起源于间充质组织的多能干细胞，具有自我更新和多向分化的潜能。此外，mscs还具有免疫调节和抗炎的功能，能够影响免疫细胞的活动，抑制炎症反应，因此在治疗自身免疫性疾病和炎症性疾病方面显示出潜在的临床应用价值。然而，mscs在临床应用中也存在一些缺点，比如潜在的致瘤性和异常分化等，这使得mscs的储存和运输存在挑战。4、cd73(也称为胞外5'-核苷酸或5'-nt，nt5e)是由两个相同亚基组成，大小约为70kd，通过糖基磷脂酰肌醇键固定于质膜外表面的一种蛋白。该蛋白广泛表达于不同类型的细胞，如淋巴细胞、内皮细胞、间充质细胞和上皮细胞。通过与另外一种核苷酸外切酶cd39协同工作，cd73参与将atp和其水解产物adp转化为腺苷，而腺苷在免疫调节中具有抗炎和免疫抑制的作用。5、非专利文献：inhibition of t-cell proliferation by murine multipotentmesenchymal stromal cells is mediated by cd39 expression and adenosinegeneration(sattler c,steinsdoerfer m,offers m,fischer e,schierl r,heseler k,w,seissler j..cell transplant.2011；20(8):1221-30)公开了cd39与cd73共同作用催化腺苷的生成，并通过与腺苷受体a2a的结合，抑制t淋巴细胞增殖。还公开了间充质干细胞表面cd39和cd73的共表达可以显著抑制t细胞的增殖以及效应性th17细胞的功能，进一步的，非专利文献：cd39-mediated effect of human bone marrow-derivedmesenchymal stem cells on the human th17 cell function(lee jj,jeong hj,kimmk,wee wr,lee ww,kim su,sung c,yang yh.purinergic signal.2014；10(2):357-65.)还公开了间充质干细胞通过cd39介导的腺苷生成途径调节人th17细胞的功能，这种免疫调节涉及th17细胞的增殖以及ifn-γ和il17a等细胞因子的分泌。可见在cd39和cd73通路中，cd39发挥着重要的作用。6、进一步的，现有技术中公开了通过抑制th1和th17分化，来治疗eau，而使用cd73抑制剂后，治疗效果却大打折扣，证明其治疗作用的关键在于通过cd73抑制th1细胞和th17细胞的分化。技术实现思路1、在现有技术的基础上，本技术进一步对cd73的免疫抑制作用进行研究。意外的发现，虽然过表达cd73能够增强囊泡对th1细胞分化的抑制作用，但对囊泡抑制th17细胞分化的程度并没有影响，有理由推断，过表达cd73的囊泡在治疗自身免疫性眼病方面，与现有技术中cd73的常规机理并不相同，而且，cd73的过表达与囊泡共同对自身免疫性眼病进行治疗，具有显著的协同作用。本技术进一步通过验证发现了过表达cd73的囊泡具有增加腺苷分泌水平、减少视网膜组织及玻璃体腔炎症细胞的浸润、减少视网膜的褶皱和脱离、减轻视网膜的肉芽肿程度，以及恢复视网膜的结构的功能。具体的：2、本发明的第一方面，提供了一种囊泡在制备治疗自身免疫性眼病的药物中的应用，所述的囊泡为过表达cd73的囊泡。3、优选的，所述的囊泡分离自过表达cd73的间充质干细胞。4、进一步优选的，所述的间充质干细胞来源于脂肪、脐带、骨髓、牙髓或胎盘中一种或两种以上。5、进一步优选的，所述的间充质干细胞来源于人或非人动物。6、在本发明的一个具体实施方式中，所述的间充质干细胞来源于人脐带组织。7、优选的，所述的过表达cd73的间充质干细胞的构建方法包括将编码cd73的核苷酸序列导入间充质干细胞。8、优选的，所述的导入包括使用包含编码cd73的核苷酸序列的载体。9、优选的，所述的载体为病毒载体，10、优选的，所述的病毒载体包括慢病毒载体、假病毒载体、腺病毒载体、腺相关病毒载体、单纯疱疹病毒载体或巨细胞病毒载体。进一步优选为慢病毒载体。11、优选的，所述的囊泡通过将过表达cd73的间充质干细胞的培养上清液经差速离心获得。12、优选的，所述的差速离心包括逐渐增加离心转速进行离心。进一步优选的，所述的差速离心包括离心和超速离心。13、在本发明的一个具体实施方式中，所述的差速离心包括：14、1)离心处理，弃去细胞膜及细胞器碎片，取上清液；15、2)将步骤1)所得上清液进行超速离心处理，取沉淀。16、优选的，步骤1)中所述离心处理的次数为1-10次，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10次。进一步优选为三次，其各自参数分别为：17、第一次：100-500g(例如100、150、200、250、300、350、400、450或500g)，1-10分钟(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10分钟)；18、第二次：1000-3000g(例如1000、1500、2000、2500或3000g)，5-20分钟(例如5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20分钟)；19、第三次：10000-30000g(例如10000、15000、20000、25000或30000g)，20-40分钟(例如20、25、30、35或45分钟)。20、在本发明的一个具体实施方式中，步骤1)所述的离心处理的次数为三次，其中，第一次离心在300g下进行5分钟；和/或，第二次离心在2000g下进行10分钟；和/或，第三次离心在10000g下进行35分钟。21、优选的，步骤2)所述的超速离心的参数包括100000-180000g(例如100000、110000、120000、130000、140000、150000、160000、170000或180000g)，50-100分钟(例如50、55、60、65、70、75、80、85、90、95或100分钟)。22、在本发明的一个具体实施方式中，步骤2)所述超速离心为在110000下进行70分钟。23、根据具体实施方式的需要，所述的超速离心包括进行一次或两次以上的超速离心，当进行两次以上的超速离心时，每次超速离心的参数可以相同或根据具体实施方案进行调整。当第一次超速离心完成后，取沉淀后使用重悬溶剂将沉淀重悬后再进行下一次超速离心。24、优选的，所述的重悬溶剂为任何适于培养细胞的缓冲液，例如pbs、pb、tris缓冲液或甘氨酸缓冲液。在本发明的一个具体实施方式中，所述的重悬溶剂为pbs。25、优选的，所述的离心处理或超速离心在0-5℃下进行，例如0、1、2、3、4或5℃。26、优选的，所述的步骤还包括在离心前去除培养基中的囊泡的步骤(优选采用离心的方法去除培养基中的囊泡，进一步优选采用11000g过夜离心的方法)。27、在本发明的一个具体实施方式中，所述的囊泡通过将过表达cd73的间充质干细胞的培养上清液经过以下步骤获得：28、1)使用去除囊泡的培养基培养间充质干细胞，收集细胞培养上清；29、2)300g离心5min，收集上清；30、3)2000g离心10min，收集上清；31、4)10000g离心35min，收集上清；32、5)110000g离心70min，弃上清，使用pbs重悬沉淀；33、6)再次110000g离心70min，弃上清，少量pbs重悬沉淀，使用滤膜过滤除菌。34、优选的，所述的自身免疫性眼病包括角膜炎、结膜炎、虹膜睫状体炎、自身免疫性葡萄膜炎、巩膜炎、视网膜脉络膜炎、增殖性玻璃体视网膜病变、糖尿病视网膜病变或老年性黄斑变性中的一种或两种以上。35、在本发明的一个具体实施方式中，所述的自身免疫性眼病为自身免疫性葡萄膜炎。36、优选的，所述的囊泡的直径为40-1000nm中任一数值，优选为100-300nm中任一数值，例如40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、135、137、140、150、151、155、160、170、180、182、190、200、210、215、216、220、230、240、245、248、250、260、270、280、290、300、350、400、450、500、550、600、650、700、750、800、850、900、950或1000nm。37、优选的，所述的囊泡包括微囊泡、凋亡小体或外泌体中的一种或两种以上。38、优选的，所述的囊泡的结构为圆形杯口状双层膜结构。39、优选的，过表达cd73的囊泡的表面标志物包括cd63或tsg101中的一种或两种以上。40、优选的，过表达cd73的囊泡通过下列任一种或两种以上的组合治疗自身免疫性眼病。41、a)抑制t细胞增殖；42、b)抑制th1细胞分化；43、c)促进treg细胞分化；44、d)增加腺苷分泌水平；45、e)减少视网膜组织及玻璃体腔炎症细胞的浸润；46、f)减少视网膜的褶皱和脱离；47、g)减轻视网膜的肉芽肿程度；48、h)恢复视网膜的结构。49、所述的药物可以为人用药或兽用药。50、所述的药物还包括药学上可接受的辅料。51、优选的，所述药物可以采用任何合适的给药方式，特别是眼内给药或静脉注射，所述的眼内给药例如滴眼液给药、眼膏给药、结膜下注射给药、玻璃体腔注射给药，特别是玻璃体腔注射给药。52、优选的，所述药物可以被配制为任何合适的制剂形式，例如，但不限于，霜、泡沫、膏、软膏、乳剂、液体溶液、滴眼剂、注射剂、粉针剂、凝胶、喷雾、悬浮液、微乳液、眼罩或隐形眼镜等，特别是注射剂或滴眼剂。53、在本发明的一个具体实施方式中，所述的囊泡或药物可以配制为溶液，优选溶液中囊泡的浓度为0.01g/l-10g/l，例如0.01g/l、0.02g/l、0.03g/l、0.04g/l、0.05g/l、0.06g/l、0.07g/l、0.08g/l、0.09g/l、0.1g/l、0.11g/l、0.115g/l、0.12g/l、0.125g/l、0.13g/l、0.14g/l、0.15g/l、0.16g/l、0.17g/l、0.18g/l、0.19g/l、0.2g/l、0.5g/l、1g/l、2g/l、3g/l、4g/l、5g/l、6g/l、7g/l、8g/l、9g/l、10g/l等。54、在本发明的一个具体实施方式中，所述的溶液为100-1000μl中任一数值(例如100、150、200、250、300、350、400、450、500、550、600、650、700、750、800、850、900、950或100μl)的包含10-150μg中任一数值(例如10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、105、110、115、120、125、130、135、140、145或150μg)的囊泡的溶液。55、所述的溶液可以为适于注射的溶液或者滴眼剂。56、优选的，配制溶液的溶剂可以选自生理盐水、注射用水、缓冲液(例如pbs)等。57、优选的，所述的囊泡独立或与其他药物联用或载药进行疾病的治疗。58、优选的，承载的药物可以为il-10、雷帕霉素或cd73。59、载药方法选自：基因工程法、化学合成法、病毒载体法、超声法、电穿孔法、共孵育法中的一种或两种以上。60、本发明的第二方面，提供了一种囊泡的制备方法，所述的囊泡为过表达cd73的囊泡。61、优选的，所述的制备方法包括将过表达cd73的间充质干细胞的培养上清液经差速离心获得。62、在本发明的一个具体实施方式中，所述的制备方法包括通过将过表达cd73的间充质干细胞的培养上清液经过以下步骤获得：63、1)使用去除囊泡的培养基培养间充质干细胞，收集细胞培养上清；64、2)300g离心5min，收集上清；65、3)2000g离心10min，收集上清；66、4)10000g离心35min，收集上清；67、5)110000g离心70min，弃上清，使用pbs重悬沉淀；68、6)再次110000g离心70min，弃上清，少量pbs重悬沉淀，使用滤膜过滤除菌。69、本发明的第三方面，提供了一种上述制备方法获得的囊泡以及其在治疗自身免疫性眼病或调节t细胞增殖或分化中的应用。70、本发明的第四方面，提供了一种治疗自身免疫性眼病或调节t细胞增殖或分化的方法，所述的方法包括向有需要的受试者施用有效量的囊泡或药物。71、优选的，所述的方法包括眼内给药或静脉注射，所述的眼内给药例如滴眼液给药、眼膏给药、结膜下注射给药、玻璃体腔注射给药，特别是玻璃体腔注射给药。72、优选的，所述的方法包括向有需要的受试者施用10-150μg中任一数值(例如10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、105、110、115、120、125、130、135、140、145或150μg)的囊泡。73、其中，囊泡可以配制为溶液，优选溶液中囊泡的浓度为0.01g/l-10g/l，例如0.01g/l、0.02g/l、0.03g/l、0.04g/l、0.05g/l、0.06g/l、0.07g/l、0.08g/l、0.09g/l、0.1g/l、0.11g/l、0.115g/l、0.12g/l、0.125g/l、0.13g/l、0.14g/l、0.15g/l、0.16g/l、0.17g/l、0.18g/l、0.19g/l、0.2g/l、0.5g/l、1g/l、2g/l、3g/l、4g/l、5g/l、6g/l、7g/l、8g/l、9g/l、10g/l等。74、在本发明的一个具体实施方式中，所述的方法包括向有需要的受试者施用100-1000μl中任一数值(例如100、150、200、250、300、350、400、450、500、550、600、650、700、750、800、850、900、950或100μl)的包含10-150μg中任一数值(例如10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、105、110、115、120、125、130、135、140、145或150μg)的囊泡的溶液。75、所述的溶液可以为适于注射的溶液或者滴眼剂。76、优选的，配制溶液的溶剂可以选自生理盐水、注射用水、缓冲液(例如pbs)等。77、本发明所述的“过表达”代表比原始表达量高或者将原始不表达的变为表达。78、本发明所述的“治疗”，表示在疾病已开始发展后减缓、中断、阻止、控制、停止、减轻、或逆转一种体征、症状、失调、病症、或疾病的进展或严重性，但不一定涉及所有疾病相关体征、症状、病症、或失调的完全消除。79、本发明术语“包括”或“包含”是开放式的描述，含有所描述的指定成分或步骤，以及不会实质上影响的其他指定成分或步骤。80、本发明所述“有效量”是指在以单个或多个剂量给予至个体或器官之后提供所希望的治疗的本发明的囊泡或药物的量或剂量。81、本发明所述的“受试者”可以为人或非人哺乳动物，也可以为人或非人哺乳动物的细胞、组织或器官，所述的非人哺乳动物可以为野生动物、动物园动物、经济动物、宠物、实验动物等等。优选的，所述的非人哺乳动物包括但不限于猪、牛、羊、马、驴、狐、貉、貂、骆驼、狗、猫、兔、鼠(例如大鼠、小鼠、豚鼠、仓鼠、沙鼠、龙猫、松鼠)或猴等等。82、本发明所述的“和/或”包含该术语所连接的项目的所有组合，应视为各个组合已经单独地在本文列出。例如，“a和/或b”包含了“a”、“a和b”以及“b”。又例如，“a、b和/或c”包含了“a”、“b”、“c”、“a和b”、“a和c”、“b和c”以及“a和b和c”。83、本发明的有益效果：84、1)打破传统cd73对免疫抑制的工作理论，通过理论和实验确定了cd73在治疗自身免疫性眼病的新机理，例如通过抑制th1细胞分化，却对th17细胞的分化不影响。85、2)cd73的过表达与囊泡共同对自身免疫性眼病进行治疗，具有显著的协同作用。例如除增加腺苷分泌水平，更具有减少视网膜组织及玻璃体腔炎症细胞的浸润、减少视网膜的褶皱和脱离、减轻视网膜的肉芽肿程度，以及恢复视网膜的结构的功能。86、3)间充质干细胞(mscs)来源的囊泡富含蛋白质和其他生物活性分子，具有调节免疫反应、促进细胞生存和修复、传递生物信息等作用。和细胞相比，msc-sevs由于具有天然的纳米级尺寸，容易通过血管等较为狭窄的地方，其致瘤性和阻塞血管的可能性大大降低；在储存和运输方面，msc-sevs在经过反复冻融之后依旧能保持较好的活性；同时，因其表面的双层脂质结构，msc-sevs具有良好的生物相容性，能够穿过血脑和血眼屏障，在递送药物、活性蛋白、核酸等方面具有潜在的治疗和研究价值。87、4)本技术通过囊泡携带cd73解决了cd73自身半衰期短，易被降解而难以长期稳定存在的问题。在体内稳定产生高剂量的腺苷。88、5)本技术选择脐带来源的mscs分离获得囊泡，相比于其他来源的mscs，脐带来源的mscs具有较低的免疫原性，因此在移植时不太容易被宿主免疫系统识别和攻击，减少了排斥反应的风险。此外，脐带是生物医学废料，产生的mscs可以通过无痛、无风险地获取。因此，脐带mscs具有易获取、低免疫原性、多潜能分化能力、高增殖能力、安全性和可塑性等优势。