一种基于多组学动态ctDNA监测食管鳞状细胞癌疗效

本发明属于癌细胞治疗监测，具体来说，涉及一种基于多组学动态ctdna监测食管鳞状细胞癌疗效的方法。背景技术：1、食管癌主要的组织学亚型为食管鳞状细胞癌(escc)。美国国家综合癌症网络指南推荐的局部晚期食管癌的标准治疗方案是新辅助放化疗加食管切除术。根据cross和neocrtec5010研究，食管癌接受新辅助放化疗之后的复发率在30％～50％之间，尤其是远处转移。因此，改善疗效的临床需求仍未得到满足。2、新辅助免疫治疗在黑色素瘤、肺癌、膀胱癌、结直肠癌等早期肿瘤中已经显示出有效的病理反应，在一定程度上改善患者的预后。新辅助免疫治疗为实时监测肿瘤反应和评估药物疗效提供了良好的机会。目前，越来越多的临床试验来评估新辅助免疫治疗对escc的作用。因此，准确预测患者对新辅助免疫治疗的反应是这方面的一个关键问题。3、血液中的循环肿瘤dna(ctdna)的检测是一种非侵入性检测方法，可以多次获取，并且可以实时监测的一种微创方法，是疾病监测和评估治疗反应的一种有效手段。有临床研究结果表明，ctdna可能在早期乳腺癌中检测分子残留病灶(mrd)和新出现的治疗耐药性(即分子复发(mr))，以及在监测晚期癌症患者的疾病进展中发挥作用。在高危早期乳腺癌中，新辅助化疗期间个性化监测ctdna可用于评估治疗反应，帮助微调病理完全缓解，作为改善预后的替代终点。4、循环游离dna 5'端基序结合mri肿瘤消退等级(mrtrg)可能预测局部晚期直肠癌对新辅助放化疗的反应。通过连续血浆取样对可切除食管腺癌进行纵向跟踪，发现术后ctdna可以识别出有复发风险的患者，这些患者可以从强化辅助化疗中获益。还有一些研究对肿瘤的异常dna甲基化进行了评估，以获得诊断或预后相关的生物标志物。然而，ctdna在评估局部晚期escc患者对新辅助免疫治疗的肿瘤反应和预后中的作用尚未阐明。技术实现思路1、针对现有技术存在的什么问题，本发明提供了一种基于多组学动态ctdna监测食管鳞状细胞癌疗效的方法。2、为实现上述技术目的，本发明采用的技术方案如下：3、一种基于多组学动态ctdna监测食管鳞状细胞癌疗效的方法，包括步骤：4、s1、对ctdna靶向测序数据和cfmedip-seq数据进行分析；5、s2、wgbs差异甲基化区域鉴定；6、s3、tcga450k甲基化芯片差异甲基化探针鉴定；7、s4、cfmedip-seq差异甲基化区域鉴定；8、s5、甲基化风险评分；9、s6、定义甲基化免疫指数作为评价指标，用于评价新辅助免疫治疗的预后；10、s7、利用logistic regression方法，构建多组学混合模型，从而得到模型风险打分。11、进一步地，步骤s1中ctdna靶向测序数据分析：12、采用fastp软件对原始测序fastq数据做过滤，去除接头序列、poly-n序列以及低质量的reads，得到clean reads；13、采用burrows-wheeler aligner将clean reads比对到ensemble grch37/hg19参考基因组；14、采用picard处理pcr重复，得到唯一比对的reads；15、采用genomeanalysis toolkit(gatk)进行局部比对和碱基再校准；16、应用gatkmutect2、vardict和varscan鉴定单核苷酸变异(snvs)、小插入和缺失(indels)；17、采用annovar基于多个数据库进行变异注释，包括群体频率数据库(1000g和exac)，疾病或表型数据库(cosmic,intervar和clinvar)以及变异预测工具(polyphen2和sift)。18、进一步地，cfmedip-seq数据分析：19、采用fastqc评估cfmedip-seq原始fastq数据质量；20、采用fastp软件去除接头序列、poly-n序列以及低质量的reads，得到cleanreads；21、采用burrows-wheeler aligner将clean reads比对到ensemble grch37/hg19参考基因组；22、利用picardmarkduplates去除pcr重复reads；23、采用macs2软件的callpeak函数获得每个样本的峰区域。24、进一步地，wgbs差异甲基化区域鉴定：25、从geo数据库中下载了escc肿瘤和匹配的健康组织的全基因组重亚硫酸盐测序的原始数据；26、采用fastp软件去除接头序列、poly-n序列以及低质量的reads，得到cleanreads；27、使用bismark软件将clean reads比对到ensemble grch37/hg19参考基因组上，并去除pcr重复的reads；28、将参考基因组拆分成300bp非重叠的窗口，每个窗口上wgbs数据的甲基化水平定义为该窗口中发生甲基化的reads总数除以发生甲基化和未发生甲基化的reads之和；29、计算完每个窗口的甲基化水平之后，对窗口进行过滤，要求在至少70％的样本中其甲基化水平高于0.7或者低于0.25；30、对于过滤之后的窗口，利用rots软件识别差异甲基化区域，作为wgbs-dmrs；31、最后，共得到182,338个wgbs-dmrs。32、进一步地，tcga450k甲基化芯片差异甲基化探针鉴定：33、从tcga数据门户网站下载食管鳞状细胞癌的infinium humanmethylation450beadchips数据，并下载相关的临床信息；34、从gene expression omnibus下载了包含656个个体的450k人类全血队列的微阵列数据；35、采用champ软件对tcga肿瘤与邻近正常样本或血源性正常样本进行差异甲基化分析，得到135,653个差异甲基化探针。36、进一步地，cfmedip-seq差异甲基化区域鉴定：37、在进行dmrs检测之前，先将ensemble grch37/hg19版本的参考基因组拆分成300bp非重叠的窗口；38、对于每一个样本，利用featurecounts计算每个bin的reads计数；39、对bin做如下过滤：仅保留至少在80％样本中reads数目大于5的bin；40、使用total reads数目作为library大小，计算每个bin上的rpkm；41、使用rots方法鉴定dmrs，阈值为pvalue<0.05，得到dmrs计数数据量；42、对所有dmrs做进一步的过滤。采用如下标准做进一步的过滤：(1)与wgbs的dmrs或者tcga 450k芯片的差异甲基化探针有重叠；(2)与免疫相关基因(https://www.innatedb.com/)、escc driver基因或者escc甲基化相关基因的启动子区域完全重叠。最终，共得到13个dmrs。43、进一步地，甲基化风险评分详细流程：44、计算以上步骤得到的cfmedip-seq的dmrs区域的rpkm个数；45、利用随机森林模型，在t0时间点的训练集队列中评估这些dmrs对预后效果的重要性，取top 60％作为候选dmrs区域；46、在t0时间点的训练集队列中基于候选dmrs区域构建lasso回归模型，并得到甲基化风险评分。47、进一步地，甲基化免疫指数计算公式：48、meti＝∑piip/∑ni，49、piip表示与免疫基因启动子有重叠的峰的数目，ni为免疫基因的数目。50、进一步地，对于训练集样本，t1和t0时间点甲基化风险评分的差异(δt1-t0mets)和t1时间点的ctdna状态作为输入，采用模型风险打分对患者的疗效进行预测，使用youden指数作为风险打分的阈值；51、风险打分公式如下：52、53、公式中，α和β分别是ctdna状态和δt1-t0 mets在该混合模型中的系数，b是混合模型的截距。α、β和b分别等于47.8、48.7和-24.5。54、本发明相比现有技术，具有如下有益效果：55、整合多个时间点的基因组学和表观遗传学的动态特征，构建机器学习模型，预测食管鳞状细胞癌新辅助免疫治疗的反应，及评估食管癌预后的引物、探针组合及分类模型。