表达IL12的溶瘤弹状病毒的制作方法

本公开涉及表达白细胞介素-12的重组溶瘤弹状病毒。背景技术：1、以下段落不是承认其中讨论的任何内容是现有技术或本领域技术人员的知识的一部分。2、溶瘤病毒(oncolytic virus，ov)是有前途的抗癌治疗剂，其被设计或选择来在肿瘤细胞中感染和繁殖，同时在正常组织中具有减弱的复制能力。对一些ov的效力重要的一个特征是刺激抗肿瘤免疫应答的能力。3、在过去曾尝试患者自身癌细胞的疫苗接种(自体细胞疫苗)，并取得了不同程度的成功(1、2)。大多数采用将全细胞疫苗与非特异性佐剂混合，例如bacillus colmette-guérin(bcg)，但是在克服肿瘤微环境内免疫抑制方面的困难收效甚微(3)。尽管如此，临床试验一致表明，能够对全细胞疫苗产生免疫应答的患者的存活率明显更好，这表明当产生免疫应答时，预后得到改善(4)。4、细胞因子，例如il-12，也已被用于引导抗肿瘤免疫应答，但这些细胞因子当作为蛋白质给药时的短半衰期，以及全身给药后遇到的剂量限制性毒性，已经减少了它们潜在的有效性(5)。也就是说，基于细胞因子的疫苗的强免疫原理继续推动世界各地众多实验室开发新的实验方法。技术实现思路1、以下介绍旨在向读者介绍本说明书，而不是定义任何发明。一个或多个发明可以存在于下面或本文的其他部分中描述的元素或方法步骤的组合或子组合中。发明人不会仅仅因为没有在权利要求书中描述其他发明，而放弃或否认对本说明书中公开的任何发明的权利。2、使用溶瘤病毒治疗癌症的常见问题是使用该病毒作为单一药剂的抗肿瘤免疫激活不足。3、本领域需要用能够抗肿瘤免疫激活的ov治疗癌症的方法。此类ov可用于在肿瘤微环境中具有改善的免疫应答的自体细胞疫苗中。4、在一方面，本公开试图通过提供maraba病毒来解决或改善与溶瘤病毒治疗癌症有关的一个或多个缺点，所述maraba病毒的基因组包括编码白细胞介素-12(il12)或其功能部分的核酸序列。il12蛋白或其功能部分的表达可以增强被maraba病毒感染的肿瘤细胞的免疫原性。5、白细胞介素12也称为自然杀伤细胞刺激因子(nksf)或细胞毒性淋巴细胞成熟因子(clmf)。il-12是含有两个二硫键连接的亚基p35和p40的异二聚体细胞因子。人p35和p40蛋白的序列分别显示在seq id no：1和2中。鼠p35和p40蛋白的序列分别显示在seq id no：3和4中。人和鼠il-12在他们的p35和p40亚基中分别具有60％和70％的氨基酸序列同一性。二硫键连接的鼠p40同型二聚体可以结合至il-12受体，并且可以在体外充当il-12活性的拮抗剂。尽管与同型二聚体的活性相比活性降低，但鼠p40单体仍然可以充当il-12拮抗剂。在本公开的上下文中，p40的这些单体和同型二聚体将被认为是il12的功能部分。6、由maraba病毒编码的il12或其功能部分可以具有基本上对应于人p35和p40序列的序列。由maraba病毒编码的il12或其功能部分可以具有基本上对应于鼠p35和p40序列的序列。由maraba病毒编码的il12或其功能部分可以具有至少60％与野生型人il12相同的序列，只要il12或其功能部分能够：刺激t细胞、nk细胞或两者的生长；增强人nk/淋巴因子激活的杀伤细胞的溶解活性；通过静息(resting)人外周血单核细胞(pbmc)来刺激ifn-γ的产生；或其任何组合。7、il12可以具有来自不同来源的il12的序列的嵌合体的序列。例如，由maraba病毒编码的il12可以具有基本上对应于人p35单体的序列的序列，以及基本上对应于鼠p40单体的序列的序列。得到的异二聚体是人和小鼠il12亚基的嵌合体。如实施例中所示，尽管鼠il12和人il12在其p40和p35亚基中仅分别具有70％和60％的氨基酸序列同一性，但由maraba病毒表达的鼠il12保留其对人nk细胞的刺激特性。8、在本公开的上下文中，诸如“il12序列”的表达应当被理解为是指构成二聚体蛋白的亚基的序列的全体，而不管该亚基以何种顺序列出。因此，应该理解的是，上述关于由maraba病毒编码的il12具有至少60％与野生型人il12相同的序列的讨论，比较了由maraba病毒编码的p35和p40的序列的组合和野生型人il12的p35和p40的序列的组合。9、弹状病毒可以是野生型maraba病毒的变体。野生型maraba病毒基因组具有从3'末端到5'末端编码n、p、m、g和l蛋白的核苷酸序列。maraba病毒(美国专利号8,481,023的seqid no：1-6，通过引用并入本文；hq660076.1)根据本公开的野生型maraba病毒的变体可以具有含有以不同于3'-n、p、m、g、l-5'的顺序编码n、p、m、g和l蛋白的核苷酸序列的基因组。maraba病毒的变体可以包括：g蛋白在对应于野生型序列的位置242的位置的突变(例如q242r)；和/或基质(m)蛋白在对应于野生型序列的位置123的位置的突变(例如l123w)。包括野生型g蛋白中的q242r突变、以及野生型m蛋白中的l123w突变的野生型maraba病毒的变体，在本文中可称为“mg1”。在g蛋白的氨基酸242处和/或在m蛋白的氨基酸123处含有取代的maraba病毒如在美国专利号9,045,729的第2栏第24-42行中描述，其整体内容通过引用并入本文。溶瘤性maraba mg1病毒经过遗传修饰，在g和m蛋白中均具有突变，使其在癌细胞中具有高毒力，并在正常细胞中衰减(6)。野生型maraba病毒的变体可包括具有重排的n、p、m、g和l蛋白的核苷酸序列的基因组，以及上述g和m蛋白的突变中的一个或两个。10、il12可由一个或多个核苷酸序列编码，所述核苷酸序列位于：编码n、p、m、g和l蛋白的核苷酸序列之前；编码n、p、m、g和l蛋白的核苷酸序列之后；或编码n、p、m、g和l蛋白的任何核苷酸序列之间。例如，编码p35和p40蛋白的核苷酸序列可位于编码突变的g蛋白和l蛋白的核苷酸序列之间。在另一个实施例中，编码p35的核苷酸序列可位于编码m蛋白和突变的g蛋白的核苷酸序列之间，而编码p40蛋白的核苷酸序列可位于编码突变的g蛋白和l蛋白的核苷酸序列之间。11、为清楚起见，应该理解本公开考虑了以下任何组合：(i)改变由maraba病毒编码的蛋白质的顺序；(ii)包括g和/或m蛋白的突变，如上所述；以及(iii)改变编码il12或其功能部分的核苷酸序列的位置。12、在另一方面，本公开提供了受感染的细胞疫苗(infected cell vaccine，icv)，其中来自患者的肿瘤细胞被表达il12或其功能部分的溶瘤弹状病毒感染。在受感染的细胞疫苗中，将肿瘤细胞从患者移除，并在体外用溶瘤弹状病毒进行感染。然后可以将被病毒感染的细胞作为受感染的细胞疫苗(icv)施用给患者。溶瘤弹状病毒可以是maraba病毒，其基因组包括编码白细胞介素-12(il12)或其功能部分的核酸序列，如本文所讨论的。所述icv可以腹膜内给药；静脉内给药；鼻内、颅内、皮下、鞘内、皮内、胸内或肌肉内给药。13、为清楚起见，应该理解的是本公开考虑由溶瘤弹状病毒表达的il12或其功能部分可以与上述由maraba病毒表达的il12或其功能部分相同。14、为清楚起见，还应理解本公开考虑了以下任意组合：(i)改变由野生型弹状病毒编码的蛋白质的顺序；(ii)将编码il12或其功能部分的核苷酸序列置于编码弹状病毒蛋白的任何基因之间。15、在其他方面，本公开提供了一种治疗癌症的方法，其通过施用所公开的maraba病毒或所公开的受感染的细胞疫苗。本公开还提供了所公开的maraba病毒或所公开的受感染的细胞疫苗用于治疗癌症的相应用途。