基于BCG载体的SARS-CoV-2多表位决定簇重组活疫苗及

本发明涉及新型冠状病毒重组活疫苗，特别涉及基于bcg载体的sars-cov-2多表位决定簇重组活疫苗及制备方法。背景技术：1、目前新型冠状病毒感染的高峰已经过去，但是病毒并没有消失，还有各种变异毒株在国内外流行，疫苗和治疗药物的研发仍然不可或缺。sars-cov-2在不断变异，病毒的变异不仅会导致其传播力、致病力等发生变化，还可能引起易感染群改变、检测工具失灵、中和抗体与疫苗效果减弱或失效等风险。研究显示，现有的疫苗针虽然对新型冠状病毒变异株仍有交叉保护效果，但保护效果在下降。因此，仍需进一步推进疫苗研发，强化疫苗在广谱性、起效速度、持续时间和呼吸道免疫等方面的性能。2、目前，已有超39种新冠疫苗获批上市或紧急使用，处于临床研究阶段的新冠疫苗有180种，其中重组蛋白疫苗、病毒载体疫苗、灭活疫苗、mrna疫苗、dna疫苗的数量最多。重组蛋白疫苗利用基因工程技术将病原体靶抗原与某种表达载体蛋白相结合，在靶抗原大量表达之后纯化，注入人体后刺激机体产生免疫应答，常常需要佐剂增强免疫应答。例如，由novavax公司开发的nvx-cov2373，以重组纳米颗粒刺突蛋白作为抗原。病毒载体疫苗将编码新冠病毒刺突蛋白的基因导入载体病毒基因组中，该病毒载体进入人类细胞后，导入的基因在人体内表达，诱导机体强烈的特异性免疫反应。例如，ad5-ncov是一种由天津康希诺公司和北京生物技术研究所研发，以复制缺陷的5型人腺病毒为载体的病毒载体疫苗。灭活疫苗是一种发展较为成熟的疫苗制备技术，通过理化手段使病原体丧失致病性，但仍然保持免疫原性，刺激机体产生免疫反应，安全性较好。例如，bbibp-corv是由中国国药集团北京生物制品研究所研发的灭活疫苗，以氢氧化铝为佐剂，是我国最早获批紧急使用的疫苗之一。mrna疫苗是将被包裹的编码病原体靶蛋白的mrna直接注射到人体内，该段mrna可以在宿主细胞稳定地表达靶蛋白，刺激机体产生强烈的体液免疫和细胞免疫。绝大多数使用及研发中的新冠mrna疫苗在宿主体内表达刺突蛋白，由脂质纳米颗粒递送。dna疫苗通常由质粒dna分子组成，质粒dna分子编码一种或多种抗原。例如，第一个被批准用于covid-19的dna疫苗zycov-d。3、目前的疫苗中，灭活疫苗：制备工艺成熟、安全性高、易于保存，但病毒培养与灭活对实验室条件要求高，生产周期长。天然的病毒感染细胞后能进行复制，诱导较强的免疫应答，而灭活后的病毒由于失去了感染性而不能进行复制，无法通过诱导cd8+t淋巴细胞应答来实现长久的细胞免疫记忆。重组蛋白疫苗：利用病毒免疫原性最强的成分制成疫苗，可诱导较强的免疫应答反应，但因其仅使用单一的抗原成分，往往需要加强免疫才能维持其免疫力，并且也无法有效激活细胞免疫。病毒载体疫苗：目前应用最成熟的是腺病毒载体，腺病毒载体基因组稳定，宿主范围广，不整合到人体基因。但腺病毒属于常见的呼吸道病原体，人体内普遍存在抗腺病毒中和抗体，这些中和抗体会降低腺病毒载体疫苗诱导的免疫反应。减毒活疫苗：与天然病原体高度相似，因此可以诱导强烈且持续的免疫反应，但减毒活疫苗的保存和运输条件严格，需要冷藏和冷链运输以维持其活性。减毒活疫苗在极少数情况下有返祖引起疾病的风险。mrna疫苗：属于第3代疫苗，相比于传统疫苗需要将病原微生物及其代谢产物人工减毒、灭活，第3代疫苗特异性更强、有效性更高，且研发周期较快。然而，mrna疫苗易被降解，储存运输温度要求严格，而且人们对mrna疫苗的安全性还有很多疑惑。dna疫苗：相对稳定，易于生产和保存。然而，dna进入细胞的递送效率能否满足实际需求尚待论证，并且dna存在整合到宿主染色体与诱导自身免疫性疾病的风险。此外，dna疫苗历经递送细胞、入核转录、胞质翻译等过程，起效较慢。目前市面上的这些疫苗产品，难以有效刺激细胞免疫并长期维持；也难以应对病毒的持续变异，不断出现sars-cov-2变异株及多次加强接种后反复感染临床案例，因此，目前亟需开发其他原理的创新型疫苗。技术实现思路1、针对现有技术存在的不足，本发明以pmv261作为携带原核表达基因的载体，转化mycobacterium bovis bcg菌株获得携带多个sars-cov-2基因的重组bcg，能够通过新冠病毒多个基因片段诱发特异性免疫，通过bcg诱发非特异性免疫，两种免疫反应共同作用提高人群对新冠病毒的防御作用，以解决现有新冠疫苗存在的不能快速廉价制备、不能有效激活细胞免疫、难以应对病毒变异的问题。2、本发明为实现上述目的采用的技术方案是：基于bcg载体的sars-cov-2多表位决定簇重组活疫苗，其特征在于，以bcg为载体，携载sars-cov-2融合基因，包括：3、n+3cl融合基因，或s2+e+m融合基因，或rbd+e+m融合基因。4、进一步的，所述n+3cl融合基因的基因序列如seq id no:1所示。5、进一步的，所述s2+e+m融合基因的基因序列如seq id no:2所示。6、进一步的，所述rbd+e+m融合基因的基因序列如seq id no:3所示。7、基于bcg载体的sars-cov-2多表位决定簇重组活疫苗的制备方法，8、(1)人工合成n+3cl、s2+e+m或rbd+e+m融合基因片段；9、(2)将基因片段与质粒构建重组；10、(3)将构建成功的质粒电击转化至bcg感受态菌株内；11、(4)使用引物进行pcr验证。12、进一步的，13、所述(2)的步骤包括将融合基因片段分别与经bamh i和sal i双酶切的线性化的pmv261质粒重组反应并转化e.coli dh5α感受态细胞，挑卡那霉素抗性菌落做双酶切与测序鉴定。14、进一步的，15、所述(3)的步骤包括将构建成功的pmv261-n+3cl、pmv261-s2+e+m或pmv261-rbd+e+m质粒电击转化bcg感受态菌株，电转后涂布含有40μg/ml卡那霉素的7h10固体平板，37℃培养4-5w。16、进一步的，17、所述(4)的步骤包括挑取生长出来的单克隆接种含有40μg/ml卡那霉素的7h9液体培养基，37℃培养4 -5w后，收集菌体煮沸裂解，以裂解液为模板，pcr验证质粒是否转入菌株中。18、进一步的，19、pcr验证引物为：20、pmv261-n+3cl验证引物：21、上游：5’-cctcatcacgtagtcgcaacagt-3’22、下游：5’-tgcagcaggaagaagagtcacag-3’23、pmv261-s2+e+m和pmv261-rbd+e+m验证引物：24、上游：5’-gccagtgctcaaaggagtcaa-3’25、下游：5’-gccataacagccagaggaaaa-3’。26、进一步的，27、电击转化bcg感受态菌株的步骤包括：挑取bcg菌株接种于7h9液体培养基中，37℃静置培养3-4w至对数生长期，od600nm＝0.5-1.0，冰浴1h后4℃、6500rpm离心20min收集菌体，将菌体用4℃下的10％的无菌甘油洗涤3次，最后用1ml的10％的甘油重悬菌体，每管100μl分装置-80℃冻存备用。28、本发明多抗原靶位设计，应对sars-cov-2的突变：重组卡介苗涉及多个sars-cov-2蛋白，包括了sars-cov-2的n、3cl、s2、rbd、e和m蛋白，若其中某个蛋白发生突变，则其他抗原靶点还可发挥作用，提供免疫效果；特异性和非特异性免疫共同作用提高对sars-cov-2的防御：特异性免疫为rbcg通过分泌sars-cov-2特异性抗原诱导机体免疫，产生针对sars-cov-2抗原的特异性体液和细胞免疫，从而对covid-19产生防御作用，非特异性免疫为bcg具有非凡的佐剂活性，能够诱导训练免疫，bcg诱导的训练免疫可以诱导有益的免疫反应，并通过刺激病原体识别受体激活先天免疫细胞，在提高疫苗效力方面发挥关键作用，从而诱导对sars-cov-2感染的特异性保护。