提高细菌的稳定性的组合物的制作方法

本发明涉及微生物培养物的包封，以提高储存时的稳健性和稳定性。特别是，本发明涉及微生物培养物(例如乳酸菌(lab))的干制剂，其由在环境温度下长时间储存时提高存活率并减轻后酸化的脂肪基质包裹。背景技术：0、发明背景1、通常的做法是通过冷冻干燥或喷雾干燥来生产干燥的微生物以延长应用和储存。这些干燥的微生物旨在用于工业和食品应用，例如制作酸奶、奶酪和作为益生菌。干燥的微生物以高度浓缩的形式生产，然后添加到食物和饲料基质中或在赋形剂中稀释。同样明显的是，在环境温度下储存时，干燥的微生物在一定程度上降解，特别是细胞活力，从而丧失功能活性。此外，众所周知，温度升高和高湿环境的结合显著增加了干燥微生物在储存时的活力损失。在文献中已经尝试了各种方法，例如在微生物干燥前添加冷冻保护剂和干燥后添加脂肪包衣，以克服周围潮湿环境对干燥微生物的应力，但收效甚微。因此，在周围潮湿环境中生产货架期稳定的干燥微生物仍未达到目标。2、lab采用发酵工艺生产，然后进行细胞浓缩步骤以获得细胞生物质。在干燥之前，将冷冻保护剂添加到细胞生物质中，以提高工艺和储存稳定性。3、包含生物活性微生物的稳定干粉组合物是本领域已知的，例如参见wo2010138522a2。然而，仍然需要改进适合于微生物的工艺和制剂。技术实现思路0、发明概述1、本发明试图通过提供特别适用于活微生物如益生菌的微囊化的改进来克服现有解决方案中的缺点。2、本发明总体上涉及改进在包封前添加到微生物培养物中的保护性化合物。特别是，本发明公开了用特定疏水含量的冷冻保护剂和/或冻干保护剂制备干燥微生物培养物的方法，这使得微生物培养物在后巴氏灭菌步骤期间以及随后在环境温度下的整个储存过程中保持活力。微生物培养物构成了改进的生物相容性选择，适用于其中微生物培养物必须在巴氏灭菌步骤之前添加的应用。3、因此，本发明的目的涉及提供为微生物培养物提供增强稳定性的组合物。4、根据第一方面，提供了制备包含微囊化微生物培养物的组合物的方法。该方法包括以下步骤：获得微生物培养物的浓缩细胞团；向浓缩细胞团中添加保护性化合物以获得混合物；将混合物放置特定时间；将混合物干燥以获得干燥的混合物；任选地研磨干燥的混合物以获得粉末；包被粉末或混合物；并任选地将包被的粉末或混合物与赋形剂混合；其中所述保护性化合物是疏水含量大于2％(按重量)的冷冻保护剂和/或冻干保护剂。5、在一个实施方案中，保护性化合物是疏水含量大于3％(按重量)的冷冻保护剂和/或冻干保护剂。6、在一个实施方案中，调节放置时间以使得放置后的ph比放置前低1个至1.5个单位。7、在一个实施方案中，放置时间在1小时至8小时之间。8、在优选的实施方案中，放置时间为2小时。9、在一个实施方案中，放置步骤在约10℃(例如10℃)的温度下进行。10、在一个实施方案中，包衣是脂肪包衣。11、在一个实施方案中，该方法还包括将颗粒和赋形剂混合物的水活度(aw)调节至约0.35的步骤。12、在一个实施方案中，保护性化合物是冷冻保护剂和/或冻干保护剂，其包括选自由麦芽糊精、低聚果糖、果胶、黄原胶、osa淀粉和抗坏血酸钠组成的清单的至少一种成分。13、在一个实施方案中，赋形剂是碳酸钙。14、根据第二方面，提供包含通过根据第一方面的方法制备的微囊化微生物培养物的组合物，其中所述组合物在环境温度下稳定至少12周且log10损失小于4cfu/g。15、根据第三方面，提供包含微囊化微生物培养物的组合物，其包括包含保护性化合物和包衣的粉末，其中该保护性化合物是疏水含量大于2％(按重量)的冷冻保护剂和/或冻干保护剂。16、在一个实施方案中，保护性化合物是疏水含量大于3％(按重量)的冷冻保护剂和/或冻干保护剂。17、在一个实施方案中，所述保护性化合物是冷冻保护剂和/或冻干保护剂，其包括选自由麦芽糊精、低聚果糖、果胶、黄原胶、osa淀粉和抗坏血酸钠组成的清单的至少一种成分。18、在一个实施方案中，组合物还包含赋形剂。19、在一个实施方案中，赋形剂是碳酸钙。20、在一个实施方案中，通过选自由脱水、流化床干燥、冷冻干燥、真空干燥和喷雾干燥组成的组的方法进行干燥。21、在一个实施方案中，包衣是脂肪包衣，其包含选自由氢化植物油、氢化棕榈脂肪酸衍生物、饱和脂肪酸的甘油酯、甘油酯、棕榈硬脂、蜂蜡、巴西棕榈蜡、小烛树蜡、乳化蜡和大豆蜡组成的组的脂肪。22、在一个实施方案中，脂肪是第一脂肪和第二脂肪的掺混物，其中第一脂肪是氢化植物油和第二脂肪选自包含棕榈硬脂、蜂蜡、巴西棕榈蜡、小烛树蜡、乳化蜡和大豆蜡的组；或者其中第一脂肪是氢化棕榈脂肪酸衍生物和第二脂肪选自包含棕榈硬脂、蜂蜡、巴西棕榈蜡、小烛树蜡、乳化蜡和大豆蜡的组；或者其中第一脂肪是饱和脂肪酸的甘油酯和第二脂肪选自包含棕榈硬脂、蜂蜡、巴西棕榈蜡、小烛树蜡、乳化蜡和大豆蜡的组；或者其中第一脂肪是甘油酯和第二脂肪选自包含棕榈硬脂、蜂蜡、巴西棕榈蜡、小烛树蜡、乳化蜡和大豆蜡的组。23、在一个实施方案中，微生物培养物选自乳杆菌属(lactobacillus)、霍尔扎普菲尔氏菌属(holzapfelia)、淀粉乳杆菌属(amylolactobacillus)、蜂乳杆菌属(bombilactobacillus)、伴生乳杆菌属(companilactobacillus)、石墙乳杆菌属(lapidilactobacillus)、农田乳杆菌属(agrilactobacillus)、施莱弗乳杆菌属(schleiferilactobacillus)、腐败乳杆菌属(loigolactobacilus)、乳酪杆菌属(lacticaseibacillus)、广泛乳杆菌属(latilactobacillus)、德拉格里奥氏菌属(delaglioa)、液体乳杆菌属(liquorilactobacillus)、联合乳杆菌属(ligilactobacillus)、乳植物杆菌属(lactiplantibacillus)、糠乳杆菌属(furfurilactobacillus)、寡食乳杆菌属(paucilactobacillus)、粘液乳杆菌属(limosilactobacillus)、果实乳杆菌属(fructilactobacillus)、醋乳杆菌属(acetilactobacillus)、蜜蜂乳杆菌属(apilactobacillus)、促生乳杆菌属(levilactobacillus)、次乳杆菌属(secundilactobacillus)和迟缓乳杆菌属(lentilactobacillus)、明串珠菌属(leuconostoc)、片球菌属(pediococcus)、乳球菌属(lactococcus)、链球菌属(streptococcus)、肠球菌属(enterococcus)、丙酸杆菌属(propionibacterium)、双歧杆菌属(bifidobacterium)、短杆菌属(brevibacterium)、酵母菌属(saccharomyces)和葡萄球菌属(staphylococcus)中一种多多种。24、在优选的实施方案中，微生物培养物选自由动物联合乳杆菌(ligilactobacillusanimalis)(dsm 33570)、动物双歧杆菌乳亚种(bifidobacterium animalissubsp.lactis)(dsm 15954)、嗜酸乳杆菌(lactobacillus acidophilus)(dsm 13241)、嗜热链球菌(streptococcus thermophilus)(dsm 15957)和乳酸乳球菌乳酸亚种(lactococcus lactis subsp.lactis)(dsm 21404)组成的组。25、在特别优选的实施方案中，微生物培养物是动物联合乳杆菌(dsm 33570)。26、定义27、在更详细地概述本发明之前，首先定义一组术语和约定：28、微生物培养物29、在本上下文中，术语“微生物培养物”是指微生物群落。微生物包括所有单细胞生物，如古生菌和细菌，但也包括许多多细胞生物，如真菌和藻类。30、益生菌培养物31、在本上下文中，术语“益生菌”或“益生菌培养物”是指微生物培养物，当其以活细胞的形式被人或动物摄入时，可以改善健康状况，例如通过抑制胃肠道中的有害微生物、通过增强免疫系统或通过促进营养物的消化。益生菌也可以施用于植物。益生菌培养物可以包括细菌和/或真菌。32、乳酸菌(lab)33、在本上下文中，术语“乳酸菌(lab)”是指一组革兰氏阳性、过氧化氢酶阴性、无运动性、微需氧或厌氧细菌，其通过产生包括作为主要产生酸的乳酸、乙酸、甲酸和丙酸的酸来发酵糖。工业上最有用的乳酸菌包括但不限于乳球菌种(lactococcus species，spp.)、链球菌种(streptococcus spp.)、乳杆菌种(lactobacillus spp.)、明串珠菌种(leuconostoc spp.)、片球菌种(pediococcus spp.)、短杆菌种(brevibacterium spp.)、肠球菌种(enterococcus spp.)和丙酸杆菌种(propionibacterium spp.)。另外，属于严格厌氧菌组的产乳酸细菌，双歧杆菌，即双歧杆菌种，其经常单独或与乳酸菌组合用作食物起子培养物，通常包括在乳酸菌组中。甚至葡萄球菌(staphylococcus)属的某些细菌(例如，肉葡萄球菌(s.carnosus)、马胃葡萄球菌(s.equorum)、松鼠葡萄球菌(s.sciuri)、小牛葡萄球菌(s.vitulinus)和木糖葡萄球菌(s.xylosus))也被称为lab(seifert&mogensen(2002))。34、活力35、在本上下文中，术语“活力”是指培养物中的活细胞。因此，细胞培养物的活力可以通过测量菌落形成单位(cfu)的数量来确定。cfu是指任何在培养皿上生长的微生物的单个菌落的数量。该值反过来表示当细菌或真菌在平板上形成菌落时能够复制的细菌或真菌的数量。36、简而言之，cfu/g可被测定如下：用特定体积的稀释液(1:100)将已知量的样品(例如冻干的)用拍打式均质器匀化，然后用涡旋混合器将溶液重悬，然后用蛋白胨盐水稀释液(也称为“最大恢复稀释液(mrd)”)进行十进制稀释。mrd包括蛋白胨、nacl和去矿物质水。将稀释液倒在平板上，与mrs琼脂(hi-media,m641)混合并孵育。孵育后，手动计数菌落。37、具体地，使用以下测定，通过计数菌落形成单位(cfu)/克来评估样品的稳定性。在稳定性研究期间，测定在冷冻干燥后立即取样且在选定时间点取样的冷冻干燥颗粒中的活细胞数。使用标准倾注平板法。将冻干材料悬浮在无菌蛋白胨盐水稀释液(bd difcotm乳酸菌mrs琼脂,fisher scientific)中，并使用拍打式均质器(biomérieux,inc.durham,nc)拍打式均匀化。复活30分钟后，重复拍打式均质，并将细胞悬液在蛋白胨盐水稀释液中连续稀释。对于以dsm 15954保藏的动物双歧杆菌乳亚种的cfu，将稀释液一式两份铺于补充有0.5g/l l-半胱氨酸盐酸盐(sigma-aldrich,inc.)的mrs琼脂(bd difcotm乳酸菌mrs琼脂,fisher scientific)上。将琼脂平板在37℃下厌氧孵育3天。对于以dsm 33570保藏的动物联合乳杆菌la51的cfu，将稀释液一式两份铺于mrs琼脂(bd difcotm乳酸菌mrs琼脂,fisher scientific)上。将琼脂平板在37℃下厌氧孵育3天。对于嗜热链球菌th4(dsm15957)cfu，将稀释液一式两份铺于补充有0.5g/l磷酸二氢钠(sigma-aldrich,inc.)和0.5g/l磷酸氢二钠(sigma-aldrich,inc.)的m17琼脂(bd difcotm乳酸菌mrs琼脂,fisherscientific)上。将琼脂平板在37℃下有氧孵育3天。对于乳酸乳球菌乳亚种r607(dsm21404)的cfu，将稀释液一式两份铺于补充有0.5g/l磷酸二氢钠(sigma-aldrich,inc.)和0.5g/l磷酸氢二钠(sigma-aldrich,inc.)的m17琼脂(bd difcotm乳酸菌mrs琼脂,fisherscientific)上。将琼脂平板在37℃下有氧孵育3天。选择具有30个至300个菌落的平板用于计数菌落形成单位(cfu)。结果以平均cfu/g冻干样品报告，根据重复项计算。38、微囊化39、在本上下文中，术语“微囊化”是指实体，其在微米尺度上与周围环境隔绝。因此，微囊化微生物培养物是微生物培养物，其被分隔成彼此独立的实体，并与分散在其中的培养基分离。40、粉末41、在本上下文中，术语“粉末”是指平均粒径在40μm至250μm之间，优选在100μm至250μm之间的研磨颗粒。42、复合物团聚体43、在本上下文中，术语“复合物团聚体”是指富含微生物培养物的水相(或液滴)，其通过使用两种或更多种相反电荷的生物聚合物进行复合凝聚而形成。复合物团聚体是由于液-液相分离而形成的，且是与稀相平衡存在的密相。因此，复合物团聚体可以表征为亲液胶体。44、复合团聚的方法包括将待包封的实体(例如微生物培养物)与至少两种电荷相反的生物聚合物混合。在本文中，电荷相反的生物聚合物被称为团聚组分，并分别包含在第一基质和第二基质中。45、抗氧化剂46、在本上下文中，术语“抗氧化剂”是指抑制氧化的化合物。抗氧化剂可以是工业化学品或天然化合物。如本文所用，抗氧化剂包括但不限于柠檬酸三钠、维生素c、维生素e、谷胱甘肽及其衍生物。47、应当理解，本文所用的抗氧化剂包括维生素c的矿物盐，例如抗坏血酸钠。此外，维生素e应理解为包括生育酚和生育三烯酚(α，β，γ，δ)的所有变体。48、疏水包衣49、在本上下文中，术语“疏水包衣”是指位于复合物团聚体表面的疏水层或壳。这种疏水层或壳可以包含一种或更多种疏水化合物或分子，其包含导致复合物团聚体外表面疏水的疏水部分。50、食品级成分51、在本上下文中，术语“食品级成分”是指任何无毒且食用安全并符合《美国食品化学法典》(fcc)的化合物。食品级成分包括但不限于可改变香味、风味、酸度、颜色、粘度和质地等属性的化合物，以及防腐剂、营养素、增稠剂、甜味剂和乳化剂。52、首选的食品级成分包括但不限于乳糖、麦芽糊精、乳清蛋白、酪蛋白、玉米淀粉、膳食纤维、树胶和明胶。53、药物成分54、在本上下文中，术语“药物成分”是指药物制剂中非活性成分的成分。55、药物成分包括但不限于碳酸钙、羧甲基纤维素钠、滑石粉、聚二甲基硅氧烷、羟丙基纤维素和羟丙基甲基纤维素。56、赋形剂57、在本上下文中，术语“赋形剂”是指与药物的活性成分或药物成分(非活性成分的成分)一起配制的天然或合成物质，包括用于稳定、扩展或赋予最终剂型中活性成分治疗增强的目的，例如促进药物吸收、降低粘度、增强溶解度、调节张力、减轻注射部位不适、降低冰点或增强稳定性。58、赋形剂包括但不限于微晶纤维素、二氧化钛和硅酸铝。59、储存稳定性60、在本上下文中，术语“储存稳定性”是指微囊化微生物培养物在加速储存条件下长时间储存时保持活力的能力，例如在25℃的温度和水活度(aw)≤0.35的情况下储存12周。食品的aw是微囊化微生物培养物本身的蒸汽压(当与周围空气介质处于完全不受干扰的平衡时)与相同条件下蒸馏水的蒸汽压之间的比率。在本上下文中，aw通过电阻式电解湿度计、电容式湿度计或露点湿度计来测量。61、可通过分析存活微生物细胞的数量如何随时间发展来确定储存稳定性。如本文所述，通过测定cfu/g来测量微生物培养物的活力。因此，微囊化微生物培养物的储存稳定性的测量可通过评估在加速储存条件下储存0周、2周、4周、8周和12周时微囊化微生物培养物的干粉的cfu/g来确定。