一种提取于鸡软骨的含二型胶原蛋白的软骨粉及

本发明属于蛋白提取，具体是指一种提取于鸡软骨的含二型胶原蛋白的软骨粉及制备方法。背景技术：1、胶原蛋白是人体中含量较高的功能性蛋白，占人体蛋白质总量的三分之一，包含29种亚型，根据不同的生物功能分布于不同的结缔组织中，胶原蛋白具有特征性的g-x-y重复序列和三螺旋结构特征，其中甘氨酸（gly）序列中含量最高，占所有氨基酸总含量的33%，位置x和位置y通常为脯氨酸和羟脯氨酸，能够通过多级自组装形成复杂的高级结构，为结缔组织提供结构的完整性；胶原蛋白为细胞外基质的主要成分，通过与细胞表面的多种受体的相互作用，调控细胞的增殖、迁移和分化等行为；ii型胶原蛋白是关节软骨细胞外基质的主要成分，占软骨蛋白的90-95%，ii型胶原蛋能够与其他组织特异性胶原蛋白和糖蛋白形成具有减震功能的特异性胶原纤维，ii型胶原通过氢键作用力、偶极-偶极键合作用力、离子键和范德华力相互作用维持三链螺旋结构，但ii型胶原蛋白的三螺旋结构容易受到环境的影响，例如，当温度升高时，会削弱肽链之间的氢键作用力，从而使肽链去螺旋化，导致蛋白质的整体性紊乱，此类变化容易导致ii型胶原的变性，引起结构和活性的变化，减弱相关细胞与ii胶原蛋白分子之间的相互作用，从而不能维持正常的关节功能。鸡软骨中富含胶原蛋白，占鸡软骨湿重的50%以上，鸡软骨中胶原主要为ii型胶原蛋白，通过纤维束交织形成网架结构，从而维持软骨的稳定性，鸡软骨中还包括高度亲水的糖蛋白分子，由一个核心糖蛋白连接氨基多糖侧链组成硫酸软骨素和硫酸角质素，能够增加鸡软骨的弹性。鸡软骨中能够提取硫酸软骨素和ii型胶原蛋白，但在提取过程中，ii型胶原蛋白容易受到环境影响而发生变性，从而失去ii型胶原蛋白活性。技术实现思路1、针对上述情况，为克服现有技术的缺陷，本发明提供了一种提取于鸡软骨的含二型胶原蛋白的软骨粉及制备方法，本发明通过des联产提取法，对鸡软骨中的ii型胶原蛋白和硫酸软骨素进行连续提取，能够保留ii型胶原蛋白的完整构象，保持ii型胶原蛋白活性，同时提高提取效率，并对ii胶原蛋白和硫酸软骨素进行改性，提高ii型胶原蛋白和硫酸软骨素的作用效果。2、为了实现上述目的，本发明采取的技术方案如下：本发明提出了一种提取于鸡软骨的含二型胶原蛋白的软骨粉，所述软骨粉包括如下重量份的组分：钙化ii型胶原蛋白30-40份、富离子硫酸软骨素20-30份、透明质酸10-20份、维生素c1-3份、氨基葡萄糖1-5份。3、本发明还提供一种提取于鸡软骨的含二型胶原蛋白的软骨粉的制备方法，具体包括以下步骤：4、s1、将ii型胶原蛋白粉溶解于去离子水中，调节ph至9.3，加入碱性蛋白酶，升高反应温度至50℃，反应4h后，升高温度至90℃灭酶处理15min，离心取上清，干燥得到小分子ii型胶原蛋白；5、s2、将步骤s1中的小分子ii型胶原蛋白溶解于去离子水中，调节ph至7，加入谷氨酰胺酶，调节反应温度至50℃，酶解60min，后，升高温度至90℃灭酶10min，离心后取上清，冷冻干燥得到预钙化ii型胶原蛋白肽；6、s3、将步骤s2所制备的预钙化ii型胶原蛋白肽溶解于去离子水中，加入cacl2溶液，反应30min后，4000rpm下离心20min，取上清液透析处理，冷冻干燥后得到钙化ii型胶原蛋白；7、s4、将硫酸软骨素粉溶解于去离子中，调节ph至9，按照体积比1:1加入金属离子混合溶液，升高反应温度至50℃，反应90-120min后，加入95v%乙醇溶液，进行醇沉，过滤，将沉淀置于37℃烘箱中烘干，得到富离子硫酸软骨素；8、s5、将钙化ii型胶原蛋白、富离子硫酸软骨素溶解于去离子水中，加入氨基葡萄糖、透明质酸、维生素c，升高温度至50-60℃，搅拌1-2h，待反应体系冷却至室温后，冷冻干燥，得到软骨粉。9、优选地，在步骤s1中，所述ii型胶原蛋白粉在去离子水中的质量分数为5-10%；10、优选地，在步骤s1中，所述碱性蛋白酶的酶底比为0.10-0.15%；11、优选地，在步骤s2中，所述小分子ii型胶原蛋白在去离子水中的质量分数为2%；12、优选地，在步骤s2中，所述谷氨酰胺酶的酶底比为1-2%；13、优选地，在步骤s3中，所述预钙化ii型胶原蛋白肽在去离子水中的质量分数为10-12%；14、优选地，在步骤s3中，所述cacl2溶液的质量浓度为60g/l，所述预钙化ii型胶原蛋白与cacl2之间的质量比为1:3-4；15、优选地，在步骤s4中，所述金属离子混合溶液为氯化锌和氯化锶的去离子水溶液，其中氯化锌的质量浓度为4g/l，氯化锶的质量浓度为2g/l。16、优选地，所述ii型胶原蛋白粉和硫酸软骨素采用des联产方法进行提取，具体提取方法包括如下步骤：17、①、取新鲜鸡软骨切段，以40℃烘干至恒重，用钢磨打碎呈粉末状，过40目筛，得到鸡软骨粉；18、②、将苄基三丁基溴化铵和柠檬酸置于烧杯中按照80rpm速度进行匀速搅拌，升高反应温度至70℃，逐滴加入去离子水形成均一透明的溶液，冷却后得到胶原蛋白提取液；19、③、将步骤①所制备的鸡软骨粉置于烧杯中，加入步骤②所制备的胶原蛋白提取液，置于40℃水浴中进行搅拌反应4h后，置于10000rpm下离心15min，分离上清液和沉淀，将沉淀用去离子水进行洗涤，干燥后，以待备用，取上清液加入无水乙醇静置过夜后，以5000rpm离心15min，弃上清，用去离子水重悬洗涤，冷冻干燥，得到ii型胶原蛋白粉；20、以季铵盐阳离子化合物和柠檬酸对ii型胶原蛋白进行提取，能够提高对于ii型胶原蛋白的提取效率，同时能够保持胶原蛋白结构的稳定性，长链烷基和苄基的引入能够有效促进提取时的相分离效应，提升高分离效率；21、④、将氯化胆碱和尿素进行混合，按照120rpm速度匀速搅拌，升高反应温度至80℃下，逐滴加入去离子水直至溶液澄清透明，冷却得到硫酸软骨素提取液；22、采用氯化胆碱和尿素作为提取溶剂，由于尿素的分子较小，能够提高电荷传递，削弱分子间强度，增加软骨基质向溶剂的传质运动，从而提高对于硫酸软骨素体的提取效率，同时，具有酸性的硫酸软骨素能够与偏碱性的nadess形成可溶性盐，分解软骨基质中的o-糖苷键，在提高提取效率的同时能够保持硫酸软骨素的结构稳定性；23、⑤、将步骤③中沉淀置于烧杯中，加入步骤④所制备的硫酸软骨素提取液，置于100℃下进行持续搅拌反应，2h后，在5000rpm下离心30min，收集上清液，加入无水乙醇静置过夜，10000rpm离心10min，取沉淀用去离子重悬，置于10kda透析袋中，4℃透析2d，冷冻干燥，得到硫酸软骨粉；24、优选地，在步骤②中，所述苄基三丁基溴化铵和柠檬酸之间的摩尔比为1:0.8-1；25、优选地，在步骤②中，所述去离子水的添加量反应底物质量的10-20%；26、优选地，在步骤③中，鸡软骨粉与胶原蛋白提取液之间的料液比（g/ml）为1:20-30；27、优选地，在步骤④中，所述氯化胆碱和尿素之间的摩尔比为1:0.6-1.2；28、优选地，在步骤④中，所述去离子水的添加量反应底物质量的20-25%；29、优选地，在步骤⑤中，所述步骤③中的沉淀与硫酸软骨素提取液之间的料液比（g/ml）为1:10-20。30、本发明取得的有益效果如下：31、本发明提供一种提取于鸡软骨的含二型胶原蛋白的软骨粉及制备方法，本发明通过des联产提取法，对鸡软骨中的ii型胶原蛋白和硫酸软骨素进行连续提取，能够保留ii行胶原蛋白的完整构象，保持ii型胶原蛋白活性，同时提高提取效率，并对ii胶原蛋白和硫酸软骨素进行改性，提高ii型胶原蛋白和硫酸软骨素的作用效果；本发明采用谷氨酰胺酶对ii型胶原蛋白进行预钙化处理，能够提高肽链上的羧基位点，从而使钙离子与胶原蛋白进行有效的结合，能够通过激活tgf-β/smads通路，从而影响细胞周期，以促进软骨细胞的增殖；本发明采用多金属离子对硫酸软骨素进行化学修饰，金属离子的释放能够抑制炎症，增加胶原蛋白的合成，抑制基质金属蛋白酶的表达，从而有效提高硫酸软骨素的骨修复能力。