一种茶多酚的提取方法及茶多酚饲料添加剂与流

本发明涉及茶多酚的提取领域，尤其涉及基于制备饲料添加剂的茶多酚的提取技术。背景技术：1、茶多酚，是一类含有多个酚羟基并具有多种生物学活性的植物次生代谢产物，因其突出的抗氧化、抗肿瘤、抗炎抑菌等诸多活性功效而受到广泛研究和关注。然而，茶多酚稳定性差，体系相容性不佳等问题严重制约了茶多酚的广泛应用。首先，在光照、温度、ph、金属离子等因素影响下，茶多酚易被氧化成邻醌类及联苯酚醌物质，使其在贮存、加工过程中极易发生降解。其次，茶多酚与产品基质的相容性不佳，通常难以将茶多酚直接应用于产品体系中。2、在常温下，茶多酚呈白色结晶状，但是在提取过程中，茶多酚很容易发生氧化或者聚合反应，因此通常见到的茶多酚都呈淡黄色至褐色，带有涩味，略带茶香；茶多酚可沉淀蛋白质、生物碱、消化酶、多糖和金属离子形成沉淀，从而降低机体对有效物质的消化吸收，一直被认为是抗营养物质。且茶多酚具有很强的苦涩味，适口性差，直接添加到饲料中会大大降低猪的采食量，影响生长过程；且未经保护处理的茶多酚到达猪的胃中，会结合胃里的蛋白质等有效物质，破坏胃内营养平衡，从而降低有效物质的消化吸收。3、考虑到常规的茶多酚为水溶性，稳定性差，其对光、湿、热均敏感，严重制约了其生产、储运及现场应用时的质量稳定性；同时考虑到茶多酚特殊的多酚结构特性，极易与蛋白质发生反应而影响其在肠道的吸收，因此天然提取的茶多酚往往在肠道的吸收率较低；而吸收后的茶多酚经过肝肠首过效应，进一步被大量代谢，从而导致茶多酚实际发挥的生物学效能非常有限。往往需要大剂量添加才能发挥一定的抗氧化和调节脂代谢效能，但是其大剂量应用时，不但使生产成本显著提高，并且会影响饲料的适口性、降低畜禽采食量，而且其极易与微量元素，重要蛋白质或酶等发生非特异性反应，影响营养物质的吸收。4、目前，从茶叶中制备茶多酚的传统方法主要分为以下三类，溶剂提取法将茶叶用极性溶剂浸渍，然后把浸取液进行液-液萃取分离，最后浓缩得到产品。当前工业化生产主要采用此法，产品收率5％～10％，产品纯度为80％～98％，所用溶剂有乙醇、乙醚、已烷及三氯甲烷等，该法生产成本高，且才有有机溶剂易造成二次污染。离子沉淀法用金属沉淀茶多酚，使其与其他提取物质分离，但该方法得到的提取物含有草酸，且使用了对动物有毒的重金属作沉淀剂。因此，该法生产的产品难达到饲料行业的要求。柱分离制备法主要为凝胶柱、吸附柱和离子交换柱法。该技术的关键是柱填充料和淋洗。研究表明，采用柱分离制备法，茶多酚得率在4％～8％之间，纯度可达98％，但柱填充料非常贵，而且要用到多种有机溶剂，不适合工业化生产。传统方法普遍存在一些问题和弊端，产品无法在安全性、价格和纯度方面全部满足饲料添加剂行业的要求。5、公开号为cn102060879b的中国专利公开了一种提取茶多酚的方法，公开了一种用蒸馏水提取茶叶粉末中的物质，并用饱和石灰水提取分离茶多酚的方法，但该方法提取温度高，容易使茶多酚氧化，且用石灰水提取容易将茶叶中的草酸也一起沉淀出来，影响茶多酚的纯度。且含有草酸的茶多酚，不适宜用在饲料中。6、公开号为cn115671189b的中国专利公开了一种从茶叶中联合提取茶多酚、茶硒肽的方法，公开了用超声破碎、超滤膜过滤、真空旋蒸浓缩、冷冻干燥处理，制备茶多酚的方法，但是根据王立清等在《茶多酚水溶液稳定性实验》中通过实验证明茶多酚在水溶液中的有效期只有17～18小时。该提取方法没有有效的手段保护茶多酚的活性物质，使得茶多酚在提取中活性物质损耗较多，且也没有对提取后茶多酚中的草酸进行处理，也会影响茶多酚的效果。7、因此如何有效提取茶多酚，使得提取的茶多酚提取物中不含草酸，并使得提取后的茶多酚在提取和储运中能有效保护活性物质，且在食用后在肠道中的吸收率提高，是目前茶多酚提取物在饲料添加剂中广泛应用的难点。技术实现思路1、根据本发明的一方面，首先要从茶叶提取出来的水溶的茶多酚，为了实现上述目的，提供一种低温超声联合脉冲电场的双重提取方法，该方法既可以有效提取水溶性的茶多酚，且能保证在提取过程中保持茶多酚的活性，具体包括如下步骤：2、s001,将绿茶清洗干净，进行冷冻干燥后做粉碎处理，得到绿茶粉碎物。在超声波提取器内置电容耦合夹，与静电放电发生器连接，形成超声技术和脉冲电场技术联用的提取装置。3、所述的粉碎，采用的是超声波粉碎，可为提取茶多酚时，增加物料分子运动频率和速度，提高物料分子的进出速度和浸出数量，从而在较低的浸提温度下获得较高的茶多酚提取量，可以缩短了浸提时间，减少了茶多酚的氧化破坏程度。4、s002,向绿茶粉碎物中加入重量为绿茶粉碎物0.5～1倍的去离子水，在温度50～60℃下，置于s001中的提取装置中进行提取，搅拌均匀，开启超声波提取器和静电放电发生器，提取20～30分钟，用滤布过滤得到第一级提取液和第一级滤渣待用；5、s003,为了提取更充分，对第一级滤渣进行再次提取，向步骤s002中的第一级滤渣加入重量为第一级滤渣0.5～1倍的去离子水，在温度为50～60℃下，置于s001中的提取装置中进行二次提取，搅拌均匀，同时开启超声波提取器和静电放电发生器，提取20～30分钟，用滤布过滤得到第二级提取液和第二级滤渣；6、开启超声波提取器的同时，开启静电放电发生器，其中，静电放电发生器型号为普瑞马eft61004ta，设置脉冲宽度20μs，脉冲场强为1～1.1kv/cm，并设置脉冲次数为28～30次。7、所述的超声波功率80～100w。8、提高脉冲电场强度和脉冲数都可以提高茶多酚提取率。这是因为随着处理时间的增加，不可逆穿孔数量增加或者可逆穿孔的修复时间延长，从而促进了茶多酚从细胞内迁移到细胞外，茶多酚提取率随着脉冲次数的增加呈现一个先上升后下降的趋势，在脉冲次数达到28～30次时，茶多酚提取率最高。这是因为当脉冲场强一定时，随着脉冲次数的增加，茶叶细胞内外两侧电荷不断积累，跨膜电位增大，更容易高于细胞膜的临界电位，茶叶组织的细胞膜持续受到电击作用，加剧了组织结构裂解，减少了茶多酚溶出的阻力，从而促进茶多酚的提取。但是，当脉冲次数达到一定数量时，组织裂解程度基本不变。过度的脉冲电场处理可能会使胞内盐离子溶出，这反而会降低细胞内外跨膜电位，不利于茶组织细胞的进一步裂解；有研究发现，脉冲电场处理可能产生少量的自由基，从而使部分活性物质发生氧化反应，破坏茶多酚的结构。此外，脉冲次数过多，反应时间过长可能会使其他胞内杂质竞争性溶出。所以，当脉冲次数超过30次时，茶多酚提取量反而有所下降。因此，本发明选取脉冲次数28～30次对茶多酚进行提取。9、茶多酚提取率随着脉冲场强的增加而呈现出先增高后降低的趋势，在脉冲场强达到1.0～1.1kv/cm时，茶多酚提取率达到最大，根据电穿孔理论，即茶细胞作为一个电容器，在低脉冲场强的脉冲电场作用下，细胞膜两侧会形成一定的电位差，如果增加脉冲场强，细胞膜两侧的电压随之增加，脉冲击穿力度增大，加速植物组织细胞裂解，更容易形成内外联通的孔道，促使胞内活性物质溶出。当脉冲场强达到1.1kv/cm，改变脉冲场强对茶多酚提取率的影响较小。但是，当脉冲场强过大时，植物细胞破坏加剧，细胞膜产生不可逆的破损，活性物质也可能被氧化分解，减少了茶多酚的提取率。电场强度是影响细胞膜电穿孔失活的主要因素之一。当电场强度超过细胞所能承受的临界值时，失活细胞的数量增加，目标产物溶出，提取率上升。理论上，较高的电场强度会有较高的提取率，但是实际情况则不然。一方面，高电场强度会引起溶液温度提高，导致目标提取物发生氧化降解；另一方面，高电场强度会造成能量浪费，对提取设备的稳定性与寿命也有一定的影响。因此，选择1.0～1.1kv/cm作为较佳电场处理强度。最后通过和超声相结合的提取方法，其破壁率可达到96.3～98.6％。利用超声波独特的机械作用产生温热效应与空化效应，导致物料内部气泡的突然产生与崩解，进而机械地破坏茶叶组织细胞壁，加速茶多酚等活性物质的溶出，同时避免茶多酚因为长时间高温氧化造成损失。它具有较高的溶剂回收率，较温和的提取温度，避免了有害溶剂的使用，能较好地保护茶多酚类成分的物理结构和生理活性。发现茶多酚、氨基酸、咖啡因等主要生化成分的浸出量明显高于常规浸提，而且能够抑制蛋白质和果胶物质的浸出，获得茶多酚提取量的最大化。10、由于过高的超声功率会加剧细胞破碎程度，氧化分解溶出的活性物质，降低茶多酚提取率。因此，选择80～100w作为较佳超声功率。提取时间对提取率的影响，再延长提取时间对多酚提取效率的贡献不大，反而使多酚在机械波和热效应的影响下不稳定，被分解或氧化成其他物质，使多酚得率降低，而提取时间越长，成本越高，因此较优时间为20～30min。11、s004,将第二级提取液和第一级提取液混合得到第三提取液，在温度10～20℃下，温度下充分搅拌；在真空度-0.09～-0.1mpa下，低温真空浓缩至绿茶粉碎物重量的0.2～0.5倍，得到茶多酚提取液，放在2～5℃低温保存；12、脉冲电场技术使生物细胞膜发生不可逆的电穿孔效应，从而导致细胞失活，有效成分溶出，可有效提取茶多酚等活性成分，而茶多酚多数存在于茶叶细胞的液泡中，而茶细胞作为植物细胞，在完整存活的情况下拥有细胞壁与细胞膜，阻隔茶多酚的溶出。因此，打破细胞壁与细胞膜是提取细胞内的茶多酚等活性物质的关键环节，而脉冲电场技术在茶叶表面会形成4～4.5μm孔径的微孔通道，在此基础上协同超声波技术，可以使孔径扩大为54～60μm；同时，超声的传质作用加速了茶叶细胞内茶多酚、儿茶素等小分子物质的溶出，茶多酚与儿茶素的提取量显著提升。因此超声波提取技术和脉冲电场技术结合起来，可以有效提高茶叶中茶多酚的提取量，但是该方法也使得茶叶中的草酸和咖啡因也大量从茶叶细胞中溢出溶于水，使得茶多酚提取液中含有了大量的草酸和咖啡因。而草酸以及草酸盐是广泛存在于植物性饲料中的一种抗营养因子，它能显著降低动物对矿物质元素的利用率，并能对很多器官造成损害，引起中毒。而咖啡因会刺激动物的神经系统，导致动物出现兴奋不安焦虑症状，因此，我们要将混入茶多酚中的草酸和咖啡因尽可能的去除。与此同时，郭子玉等在《中国科技论文》的《茶多酚的化学稳定性及其在消毒过程中的衰减动力学研究》一文中提出：茶多酚溶液在自然状态下，其质量浓度随时间变化的回归方程符合一级动力学公式，茶多酚衰减为一级动力学反应。温度能显著影响茶多酚衰减速率，高温下衰减较快；茶多酚自身质量浓度也影响其衰减速率，低质量浓度下其衰减较快。因此如果仅仅用水溶液在低温下提取茶多酚，茶多酚还是以一级动力学反应的速度不断衰减。为了阻止这种衰减，我们需要通过一种保护液将其活性基团保护起来。13、所以我们不仅要提供一种技术方案，能够使得茶多酚中的草酸和咖啡因这些对动物有副作用的物质被有效去除，而且我们还要提供一种保护机制，使得该物质能将茶多酚的活性基团被有效的保护起来。14、进一步地，除去草酸和咖啡因，并制备得到干燥的线团交联结构的活性物质和蛋白质双重包裹的茶多酚固体微球，具体为：15、s101，将明胶和牛血清白蛋白加入去离子水中在50～60℃下加热搅拌30～50分钟至完全溶解，得到蛋白质溶液；加入柠檬酸，调节ph为5.5～6.5，使蛋白质溶液中的蛋白质带负电荷；所述的蛋白质溶液的质量分数为8～12％，蛋白质溶液的等电点为4.7；所述的酪蛋白与明胶的质量比为1:6～8；16、蛋白质溶液的等电点为4.7，当ph大于等电点时，蛋白质溶液带负电荷。17、s102，将带负电的蛋白质溶液加入到茶多酚提取液中，缓慢搅拌，出现絮状凝胶状物质，继续缓慢搅拌，反应50～80min，加入聚乙二醇800，快速搅拌10～20min使得絮状凝胶状物质分散在混合液中，形成均匀的混悬液；将混悬液进行真空抽滤，所得沉淀离心洗涤，得到带负电荷的蛋白质-茶多酚微粒；所述的明胶和牛血清白蛋白总用量跟聚乙二醇800的质量比为1:(2～3)，茶多酚提取液与蛋白质溶液的质量比为1:3～5。18、传统的茶多酚提纯方法一般采用离子沉淀法，用金属沉淀茶多酚，使其与其他提取物质分离，但该方法得到的提取物含有草酸，且使用了对动物有毒的重金属作沉淀剂。因此，该法生产的产品难达到饲料行业的要求。而采用本发明的提取方法，蛋白质溶液不与草酸或咖啡因反应生成沉淀，且无害无毒，而且提取率可达32.0～36.0％,提取得到的茶多酚纯度为99.1～99.5％,草酸的含量小于0.05％，咖啡碱含量小于0.04％，因此得到的茶多酚固体微球能用在饲料中，有效促进茶多酚在小肠中的吸收。19、s103,在温度50～60℃下，用0.01％乙酸水溶液将壳聚糖配制成浓度为8～12％的壳聚糖溶液；调节ph为5.5，搅拌1个小时，壳聚糖双螺旋分子链结构水解为单链线团结构，加入赖氨酸和谷氨酰胺，继续搅拌，单链线团结构进一步转变为相互缠绕的线团结构，反应150～200分钟，赖氨酸和谷氨酰胺上的羟基和壳聚糖的氨基发生碱式反应，在壳聚糖上增加了更密集的物理交联点，形成壳聚糖交联谷氨酰胺、赖氨酸的相互缠绕的线团结构，该结构上富集大量正电荷，记为带正电荷的线团交联结构的活性物质，得到含有带正电荷的线团交联结构的活性物质的液体。20、其中，谷氨酰胺、赖氨酸和壳聚糖的质量比为1～2：2～3:10～15；21、s104,再将蛋白质-茶多酚微粒加入到含有带正电荷的线团交联结构的活性物质的液体中，调节ph为7.0左右，缓慢搅拌使蛋白质-茶多酚微粒分散均匀后停止搅拌，静止反应20～30min；再缓慢搅拌10～20min，再静止反应20～30min后，得到均匀分散的微球混合液，其中微球为带正电荷的线团交联结构的活性物质与带负电的蛋白质-茶多酚微粒形成的包覆性微球，将微球混合液进行过滤，所得沉淀离心洗涤,将离心所得样品进行冷冻干燥，制得线团交联结构的活性物质和蛋白质双重包裹的茶多酚固体微球。22、蛋白质-茶多酚微粒与含有带正电荷的线团交联结构的活性物质的液体的质量比为1:(4～8)；23、壳聚糖作为天然阳离子多糖，具有良好的生物安全性和良好的抗菌性、成膜性、阳离子吸附性、絮凝性等性能。本发明以带负电荷的蛋白质-茶多酚微粒作为吸附核心，选取阳离子生物大分子壳聚糖为包覆膜，经过改性，形成交联致密的相互缠绕交联的线团结构，并通过正负电荷两种静电结合，带正电荷的活性线团交联结构层层自组装的包覆在带负电荷的蛋白质茶多酚微粒上，形成活性线团交联结构层层包裹着蛋白质吸附茶多酚的活性微粒，起到了长久保持活性的作用。24、最后，提取完毕后干燥的茶渣中保留有茶多糖、蛋白质、纤维素、微量元素等成分，可以作为良好的饲料添加剂。进一步地，本发明还提供一种茶多酚饲料添加剂，具体为：25、将提取剩余的茶叶渣晒干，按重量份取茶叶渣5份，甘草2份，陈皮1份和白术2份，研磨制成200目超微粉，最后和线团交联结构的活性物质和蛋白质双重包裹的茶多酚固体微球以重量比8～12:1制成饲料添加剂。26、与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：27、1.本发明首先通过脉冲电场破坏茶叶细胞中多酚氧化酶的活性，为进一步细胞破壁释放茶多酚提供了前提条件，脉冲电场技术在茶叶表面会形成4～4.5μm孔径的微孔通道，在此基础上协同超声波技术，可以使孔径扩大到54～60μm，这种联用提取装置与其他提取方法相比可高频次瞬时放电击穿细胞，扩大细胞微孔通道，显著促进茶多酚的释放，具有短时高效、环保节能、精准作用的优点。该提取方法在低温下进行，避免绿茶中的热敏化合物茶多酚被氧化，对提取热敏性成分具有非常重要的意义，在制药、食品、饲料等领域具有广阔的应用前景。28、2.本发明在提取过程中，加入带负电荷的蛋白质溶液，提高了茶多酚的纯度，提取率可达32.0～36.0％,提取得到的茶多酚纯度为99.1～99.5％,草酸的含量小于0.05mg/g，咖啡碱含量小于0.04mg/g。同时利用了线团交联结构的活性物质，通过与蛋白质溶液在正负电荷作用使得蛋白质-茶多酚被包裹成固体微球，为现有技术提供了一种高生物活性、无生物毒性、稳定性良好的肠溶型茶多酚饲料添加剂及其制备方法。采用特定的材料组合及配比，获得的茶多酚固体微球产品其极易通过肠粘膜吸收进入淋巴循环，进而进入血液循环，从而高效发挥其生物学效能，无论在稳定性、肠道吸收效率和使用量等方面均表现出显著的优势。既提升了经济效益，同时也防止茶多酚被氧化或结构被破坏，可以长期保持活性。29、3.本发明还提供了所述茶多酚饲料添加剂作为饲料添加剂的应用。明显掩盖了茶多酚本身的涩味，提高了其适口性；且改变了茶多酚原料的形态，同时保证茶多酚在猪的胃中不被释放，从而避免其结合胃中的消化酶等降低营养物质的消化吸收，使其到达小肠后被释放从而发挥止泻、抑菌、抗病毒等功效。本发明利用线团交联结构的活性物质作为蛋白质-茶多酚微粒的包覆物，充分发挥了线团交联结构的活性物质的良好成膜能力及粘膜黏附特性，能够在小肠粘膜表面定植，能最大量地到达肠道部位，在中性或者弱碱性条件下，使得茶多酚有效地释放出来，且该茶多酚饲料添加剂还充分利用废弃的茶渣，变废为宝。30、4.本发明制备的茶多酚固体微球效果好；线团交联结构的活性物质成膜性好，强度高，得到的干燥的线团交联结构的活性物质和蛋白质双重包裹的茶多酚固体微球，在扫描电镜下观察呈规则的球形，表面光滑，无凹陷。方法制备过程简单，无毒，安全，所得茶多酚固体微球稳定性高，在强酸、强碱、高温条件下仍具有很高的物理稳定性。