一种利用生物酶制剂制备黑麦面包的方法

本发明涉及一种利用生物酶制剂制备黑麦面包的方法，属于食品领域。背景技术：1、在全世界范围内，大部分人在生活中将面包作为日常主食之一。常见的面包种类有小麦面包和黑麦面包等，小麦面包往往是更多消费者的第一选择。因为小麦面包具有结构蓬松，口感绵软的优点，但是小麦面包大多数都由精制面粉制作而成，其缺点也较为突出，即脂肪和糖含量较高，纤维含量低，容易导致肥胖，心血管疾病的发生。黑麦面包具有丰富的功能性营养素，如维生素，膳食纤维等受到人们的关注。但黑麦面包也具有明显的不足之处，其质地粗糙，口感较差且保质期较短。为了改善这些问题，许多人开始探究各种各样的面团改良剂对面包品质的作用机制，其中漆酶作为一种天然改良剂被证明可以用于改善面包品质。2、酶制剂的突出优势在于它的安全无毒性，并且具有环保，绿色健康的特点，被认为是面团的天然改良剂，相对于化学改良剂而言安全性更高。漆酶和可以加速蛋白质中巯基的氧化，从而形成更多的二硫键。此外，漆酶被证明可以氧化酪氨酸和酪氨酸肽，从而产生二酪氨酸键，促进蛋白质交联从而改善面筋强度结构。并且，由于黑麦面包中富含酚类化合物，所以这些酚类化合物是潜在的漆酶底物，因此漆酶可能对改善黑麦中的面筋网络结构有一定的作用。因此，本发明对于现有烘焙食品尤其是黑麦面包的制作及品质改良具有重要的意义。技术实现思路1、针对上述现有技术存在的问题，本发明提供了一种利用生物酶制剂制备黑麦面包的方法。本发明通过在面包的制作过程中加入改良剂漆酶，可使黑麦面包口感更致密，延长存储期，改良面包品质。2、本发明使用的漆酶lcc5来自c.cinerea菌株，利用primer premier 5.0软件设计lcc5扩增的引物，合成并于毕赤酵母中表达制备。将之用于黑麦面包制作，通过对比，漆酶作为改良剂显著提高面包比容、弹性、回复性，显著降低面包硬度、粘着性和咀嚼性，使得面包口感更致密，并降低面包老化速度，延长面包储藏时间。3、本发明利用生物酶制剂制备黑麦面包的方法，包括如下步骤：4、步骤1：漆酶lcc5重组表达体系制备5、利用primerpremier 5.0软件设计漆酶lcc5扩增的引物：6、上游：5′-gcgtacgtacagagcatcattggcaaccaagatactat-3′7、下游：5′-ttgcggccgcttagggagtaggggtggggacaat-3′8、以c.cinerea的cdna为模板，扩增lcc5编码基因。pcr反应体系50μl，反应条件为：98℃预变性2min，随后进行30个循环(50℃30s，55℃30s，60℃30s，65℃30s，70℃30s，72℃1min40 s)，循环后72℃延伸10min，取10μlpcr产物经1％琼脂糖凝胶电泳检测。以生物工程有限公司dna凝胶回收试剂盒通过切胶等操作将lcc5目的片段回收。9、取30ng目的片段(lcc5)及0.5μlpeasy-t1载体，25℃水浴30min，构建重组质粒。以常规化学转化方法将重组质粒转入e.coli trans1-t1感受态细胞中，转化产物涂板于lb(含1‰氨苄青霉素)平板在20-37℃培养。再将重组质粒lcc5-peasy-t3和ppic9k载体进行双酶切，将目的片段lcc5与ppic9k载体进行连接，连接产物转入到e.coli trans1-t1感受态细胞。随机挑取部分单克隆，以菌落pcr方式验证阳性克隆。10、随后制备毕赤酵母gs115感受态细胞，按照全式金质粒抽提试剂盒说明书提取lcc5-ppic9k。使用限制性内切酶sac i对质粒lcc5-ppic9k进行线性化。通过电转化方法将胶回收产物转入gs115感受态细胞中，取200μl涂板于md平板中，28℃培养箱倒置培养3天左右。11、挑取酵母单菌落于5mlbmgy试管，28℃、200rpm摇床培养24h。以基因组为模板进行扩增目的片段，判断是否为阳性克隆。将pcr产物送生工测序，通过序列比对网站将测序结果与lcc5的cdna序列进行比对。12、步骤2：漆酶lcc5的异源表达制备13、在28℃、200rpm条件下，将lcc5重组表达菌株接种于含5ml液体bmgy培养基中培养24h，转接1ml至含有100mlbmgy培养基的三角瓶，28℃，200rpm摇床培养24h；然后将菌体转接至300mlbmm培养基的1-l三角瓶里，28℃、200rpm摇床培养至od600≈1.0。培养过程中，每天添加发酵液体积0.8％的甲醇。每天取样测定酶活力。14、随后将发酵液于8000rpm下离心收集上清液。用0.8μm滤膜抽滤除杂。在冰上将收集的粗酶液用超滤浓缩仪(滤膜截留分子量为10kda)浓缩10倍。再将收集的浓缩液转移至透析袋中，两端用夹子夹紧，确保不漏液，然后放在配制好的透析缓冲液中透析，5～6h更换一次透析缓冲液，需透析3～4次。整个过程需在4℃低温下进行。最后进行阴离子交换层析，层析过程中的所有试剂都需先经0.22μm滤膜抽滤，再置于超声清洗仪中60hz，超声1h。其次，分别用nacl、ddh2o、naoh、ddh2o、高盐、ddh2o、低盐以1ml·min-1的流速冲洗阴离子交换柱，每种溶液各冲洗40min(2个柱体积)。然后，上样35ml。最后，用高盐洗脱。高盐梯度分别设置为0、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％，每个梯度洗脱两个柱体积，以1.0ml·min-1的流速手动收集，每管5ml。洗脱下来的各管经sds-page检测收集洗脱液中的蛋白纯度，将只含有单一目标条带的洗脱液收集混合。15、lcc5活性以底物abts进行检测，酶活测定反应体系及反应条件：100mmol·l-1酒石酸钠缓冲液950μl、15mmol·l-1abts 33μl、适当稀释的酶液17μl。30℃条件下反应3min，冰浴15s。反应后立即测定420nm下吸光值变化，以如下公式计算酶活力：16、e(u·l-1)＝od420×555.56。17、步骤3：黑麦面包制作18、以黑麦面粉质量50份计，加入酵母1份、鸡蛋液20份、食盐1份、糖5份、黄油2份，加入漆酶lcc51-6u。将所有配料混合均匀，揉成面团，让面团在室温下自然发酵20-40min后开始揉面。将面团置于恒温箱中醒发1-2h(温度30-40℃，湿度50-90％)。取出面团后，对面团进行排气、分割、整形处理，放入模具并附上一层保鲜膜，再次醒发1-2h(温度30-40℃，湿度50-90％)。取出醒发好的面团放入高温烤箱中烘烤(上火150-160℃，下火130-140℃)15-20min，取出面包样品，冷却至室温，放入包装袋。19、步骤4：面团微观结构的观察20、将步骤3面包制备过程中的面团置于-20至-80℃环境中冷冻12-24h冻干，取出样品后刮下面团内部粉末通过导电胶布固定在载物台上，通过离子溅射仪对待测样品表面进行1-3次约3-9min的镀金处理后，将载物台取出放置于蔡司扫描电镜载物腔内抽真空加压，以5.0k倍放大倍数对样品的横断面进行观察。21、步骤5：面包性质测定22、(1)面包比容测定23、本发明采用小米排除法测定面包的比容。在一大烧杯中装满小米，烧杯中小米的体积记录为v1。将烤制后的面包室温静置冷却1-3h后称重记录为m。将杯中小米倒出，留少许小米在杯底(厚度约为2-5cm)。将待测面包放入杯中，接着将刚刚倒出的小米装入杯中，填满。收集剩余的小米，测其体积记录为v2。以如下公式计算面包比容ρ(ml/g)：24、25、(2)面包质构特性测定26、以xt.p1us质构分析仪对黑麦面包进行tpa模式全质构特性分析，测定面包的硬度、咀嚼性、粘着性、弹性、回复性等质构参数。将烤制后的面包室温静置冷却1-3h，去除面包表面的外皮，将面包切成长度30-50mm，宽度10-30mm，高度20-30mm大小的面包样品。将处理好的面包放在质构仪的测试平台上进行测试，选用tpa模式、探头p/36r、测试前速度1.0mm/s、测试速度2.0mm/s、触发点负载5.0g、行变量50％、间隔时间30s，循环两次进行质构分析。27、(3)面包储藏特性的测定28、将烘焙好的面包室温静置冷却1-3h后，密封保存。每隔24h后用质构仪检测面包的硬度、弹性、回复性、粘着性、咀嚼性等数据值，测量三次，结果取平均值，连续3-5天。29、本发明公开了一种利用生物酶制剂制备黑麦面包的方法。本发明使用的漆酶lcc5来自灰盖鬼伞c.cinerea。本发明将漆酶lcc5用于黑麦面包制作，通过对比，漆酶作为改良剂显著提高面包比容、弹性、回复性，显著降低面包硬度、粘着性和咀嚼性，使得面包口感更致密，并降低面包老化速度，延长面包储藏时间。