一种负载脂溶性活性物质的TGase-植物蛋白肽纳米

本发明属于纳米凝胶，尤其涉及一种负载脂溶性活性物质的tgase-植物蛋白肽纳米凝胶递送系统。背景技术：1、近年来，高脂饮食引起了一系列健康问题，包括心血管疾病(cvd)、糖尿病、肥胖症、非酒精性脂肪性肝病等。总胆固醇是心血管疾病的主要危险因素。控制胆固醇水平的有效途径是减少胆固醇的吸收和合成。鉴于传统他汀类药物等降胆固醇药物的副作用，食品来源的生物活性化合物因其安全性和可接受性受到更多关注。2、白藜芦醇(3,5,4'-三羟基二苯乙烯)是一种非类黄酮多酚有机化合物，是葡萄、蓝莓、覆盆子、桑葚、花生和结叶草等多种植物产生的抗毒素。大量研究报道了白藜芦醇的健康促进作用，特别是降胆固醇作用。植物甾醇是以游离状态或与脂肪酸和糖等结合的状态存在的一种功能性成分，广泛存在于蔬菜、水果等各种植物的细胞膜中。植物固醇是植物中的一种活性成分，对人体健康有很多益处。研究发现，植物甾醇有降低血液胆固醇、防治前列腺肥大、抑制肿瘤、抑制乳腺增生和调节免疫等作用。白藜芦醇和植物甾醇都是脂溶性活性物质，代谢快，在水中溶解度低，这导致其生物利用度低，进而限制了其应用。为了达到补充营养或预防治疗价值，蛋白质/肽目前作为制备纳米凝胶的首选封装材料，能够提高生物活性物质的溶解度和稳定性。考虑到动物蛋白/多肽的缺点，如难以令人承受的高价格和素食消费者的低接受度等问题，植物蛋白/多肽在可持续性、价格低、靶向性强和环境友好方面具有很多优势，成为递送系统壁材的潜力巨大。然而，蛋白质的水解会对凝胶的形成产生不利影响。3、由上述内容可知，脂溶性活性物质水溶性差、稳定性差、吸收率低，导致生物利用度极低，因此，迫切需要提高其生物利用度。疏水活性物质的递送一直存在多重困难，构建自组装凝胶递送体系是提高脂溶性活性物质生物利用度的有效手段。食源蛋白和多肽因其良好的安全性和凝胶性被广泛用于制备疏水活性物质递送体系。大豆蛋白、燕麦蛋白、豌豆蛋白、乳清蛋白等已被用于构建脂溶性活性物质递送系统，虽然在一定程度上提高了脂溶性活性物质的生物可及性和生物利用度。但是依然存在如下问题：1.虽然很多植物蛋白的价格低廉，且安全性高，但是其水溶性很差，尤其是大豆蛋白，因此导致递送系统的水溶效果不理想。2.植物蛋白结构致密，不易消化，因此递送系统经肠道消化后不易降解，导致脂溶性活性物质释放率不高。技术实现思路1、为解决上述技术问题，本发明提出了一种负载脂溶性活性物质的tgase-植物蛋白肽纳米凝胶递送系统，本发明不仅可以提高脂溶性活性物质生物利用度，还可以有效指导纳米凝胶递送系统的构建，为疏水活性物质的高效递送和肽基纳米凝胶递送系统的构建提供理论依据和技术指导。2、为实现上述目的，本发明提供了以下技术方案：3、本发明提供一种负载脂溶性活性物质的tgase-植物蛋白肽纳米凝胶递送系统的制备方法，包括以下步骤：4、将植物蛋白肽溶于水中，搅拌至完全溶解，冷藏过夜，得到植物蛋白肽溶液；5、将脂溶性活性物质溶于乙醇中，得到脂溶性活性物质溶液；6、将tgase(转谷氨酰胺酶)溶于水中，搅拌至完全溶解，得到tgase溶液；7、将所述植物蛋白肽溶液、所述脂溶性活性物质溶液和所述tgase溶液混合，加热反应，冷却后得到负载白藜芦醇的tgase-植物蛋白肽纳米凝胶递送系统。8、进一步地，所述植物蛋白肽包括大豆肽(spp)、油菜籽肽或花生肽；所述植物蛋白肽溶液的质量浓度为0.1～0.2％；进一步优选的是大豆肽。9、进一步地，所述脂溶性活性物质包括白藜芦醇或植物甾醇；所述脂溶性活性物质溶液的浓度为6～12mg/ml；进一步优选的是白藜芦醇。10、进一步地，所述tgase溶液的质量浓度为0.15～3％。11、进一步地，混合所述植物蛋白肽溶液、所述脂溶性活性物质溶液和所述tgase溶液后，tgase的浓度为90～900u/g蛋白。以浓度为90u/g蛋白为例，tgase的浓度计算方法如下：tgase酶活为3000u/g，若tgase溶液的质量浓度为0.15％，即0.15g(450u)tgase溶于100ml水，取200μl tgase(0.9u)溶液，加入10ml植物蛋白肽溶液中(植物蛋白肽溶液的质量浓度为0.1％，即10ml植物蛋白肽溶液含0.01g蛋白)，那么tgase与蛋白比例为0.9u/0.01g蛋白，即90u/g蛋白。12、进一步地，所述加热反应为：先在50℃下加热2h，然后在90℃下加热30min。13、更进一步地，负载脂溶性活性物质的tgase-植物蛋白肽纳米凝胶递送系统的制备方法，包括以下步骤：14、将100～200mg spp溶于100ml去离子水中，搅拌至完全溶解，4℃冷藏过夜，得到spp溶液；15、将60～120mg脂溶性活性物质溶于10ml乙醇中，得到脂溶性活性物质溶液；16、将0.15～3g tgase溶于10ml去离子水中，搅拌至完全溶解，得到tgase溶液；17、在10ml所述spp溶液中加入200μl所述脂溶性活性物质溶液和200μl所述tgase溶液，涡旋混合后，先在45～55℃下加热2h，然后在90～95℃下加热30min，冷却后得到负载脂溶性活性物质的tgase-植物蛋白肽纳米凝胶递送系统，其中tgase最终浓度约为90～900u/g蛋白。18、本发明优选大豆肽包埋白藜芦醇。与蛋白质相比，多肽不仅具有胶凝能力，而且具有多种生物活性的优势，是包埋白藜芦醇的理想壁材。因此，合理利用大豆肽制备白藜芦醇负载纳米凝胶，既能满足白藜芦醇的有效包封，又能满足白藜芦醇的有效释放。纳米凝胶一旦被摄入，就会在胃肠道中降解，保证活性物质的稳定释放。同时，消化后产生的肽或氨基酸也具有生物活性，可能与生物活性化合物发挥协同作用。由于蛋白质的水解会对凝胶的形成产生不利影响，为了避免此问题，本发明使用spp制备纳米凝胶递送系统。spp之间的疏水吸引力可以将疏水基团重新埋在较大的团聚体中，最终表现为提高纳米凝胶的稳定性。tgase可以诱导谷氨酰胺残基和赖氨酸残基之间的酰基转移，是蛋白质微胶囊壁材料形成网络结构的交联剂。相比大豆蛋白，其水解物——大豆肽具有如下优势：1.水溶性更好，大豆蛋白被水解后，刚性结构被破坏，分子量降低，水溶性增强，能够提高递送系统的水溶性。2.大豆肽更容易被消化，在肠道中能够更容易降解释放，提高白藜芦醇释放率。3.大豆肽也具有凝胶能力，能够有效包埋白藜芦醇。4.大豆肽具有多重生理功能，能够与白藜芦醇发挥协同作用。但是，大豆肽也存在稳定性差，包埋效果可能不理想的问题，因此需要加入tgase。tgase是一种能够催化赖氨酸和谷氨酰胺侧链产生异肽交联的酶，使纳米凝胶不易在胃消化过程中被降解破坏，提高白藜芦醇的生物可及性；也能够增强纳米凝胶的交联结构，提高白藜芦醇的包埋率和稳定性。并且，tgase对大豆肽中的活性肽也具有保护作用，能够维护活性肽的功能活性，同时也可能在消化过程中诱导产生更多的活性肽。因此将大豆肽和tgase共同用于构建负载白藜芦醇的纳米凝胶递送系统，能够有效提高白藜芦醇的生物可及性和生物利用度，同时交联肽纳米凝胶(即本发明负载白藜芦醇的tgase-大豆肽纳米凝胶递送系统)在复杂基质中消化后仍然能释放出白藜芦醇和生物活性肽。19、本发明还提供一种通过上述制备方法得到的负载脂溶性活性物质的tgase-植物蛋白肽纳米凝胶递送系统。20、本发明还提供所述的负载脂溶性活性物质的tgase-植物蛋白肽纳米凝胶递送系统在提高白藜芦醇生物利用度中的应用。21、本发明还提供所述的负载脂溶性活性物质的tgase-植物蛋白肽纳米凝胶递送系统在制备具有降低胆固醇药物中的应用。22、与现有技术相比，本发明具有如下优点和技术效果：23、本发明通过利用植物蛋白肽和tgase制备了负载脂溶性活性物质的纳米凝胶递送系统，优选的是利用大豆肽和tgase制备了负载白藜芦醇的纳米凝胶递送系统，能够有效提高白藜芦醇的生物利用度，同时能够在胃肠消化后产生具有降胆固醇活性的物质，协助白藜芦醇共同发挥降胆固醇作用。